פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הועסק לזהות תחמוצת החנקן מתאי אנדותל העורקים שור ו אניון קיצוני superoxide של נויטרופילים האדם באמצעות ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD)<sub> 2</sub> ו – 5,5-דימתיל-1-pyroroline-N-אוקסיד, DMPO, בהתאמה.
חנקן מגיב / מינים חמצן (ROS / RNS) בריכוזים נמוכים יש תפקיד חשוב בוויסות תפקוד התא, איתות, ואת התגובה החיסונית, אך בריכוזים לא מוסדרים ופוגעים כדאיות התא 1, 2. בעוד מערכות החיים התפתחו עם מנגנוני ההגנה אנדוגני נוגדי חמצון תזונתיים להסדרת ROS דור, ROS מיוצרים ללא הרף טבעי תוצרי לוואי של חילוף החומרים הנורמלי של חמצן יכול לגרום נזק חמצוני ביומולקולות וכתוצאה מכך אובדן תפקוד החלבון, מחשוף ה-DNA, או שומנים בדם peroxidation 3, ובסופו של דבר סטרס חמצוני שמוביל לפציעה או מוות התא 4.
אניון קיצוני superoxide (O 2 • -) הוא המבשר העיקרי של כמה מינים ביותר ביותר חמצון הידועים קיימות במערכות ביולוגיות כגון peroxynitrite ו הידרוקסיל הרדיקלי. דור של O 2 • – מסמל הסימן הראשון של פרץ חמצוני, ולכן, אניTS ו איתור / או התפיסה במערכות ביולוגיות חשוב. בהפגנה זו, O 2 • – נוצר מ נויטרופילים polymorphonuclear (PMNs). באמצעות גירוי chemotactic עם phorbol-12-myristate אצטט-13 (PMA), PMN מייצר O 2 • – באמצעות הפעלת nicotinamide אדנין מונואמין פוספט (NADPH) dinucleotide 5.
תחמוצת החנקן (NO) synthase אשר מגיע בשלושה isoforms, כמו מושרה-, עצבי ו-האנדותל-NOS, או אינוס, nNOS או אינס, בהתאמה, מזרז את ההמרה של L-ארגינין ל L-Citrulline, באמצעות NADPH לייצר NO 6 . הנה, אנחנו שנוצר NO מתאי אנדותל. בתנאי סטרס חמצוני, אינס למשל יכול לעבור מייצור אין O 2 • – בתהליך הנקרא שיחררה את סוגר, אשר ככל הנראה נגרם על ידי חמצון של heme 7 או שיתוף גורם, tetrahydrobiopterin (BH 4) 8.
יש רק מעטיםשיטות אמינות לגילוי של רדיקלים חופשיים במערכות ביולוגיות, אלא מוגבלים על ידי סגוליות ורגישות. השמנה ספין משמש בדרך כלל לצורך זיהוי של רדיקלים חופשיים כרוך התגובה תוספת של קיצוני במלכודת הספין ויוצרים adduct ספין מתמשך, אשר ניתן לאתרם באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה אלקטרונים (EPR) פאראמגנטיים. את adducts קיצוניים שונים מציגים מגוון ייחודי אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות את הרדיקלים הנוצרים והוא יכול לספק מידע רב על הטבע ועל קינטיקה של ייצור רדיקלי 9.
Nitrones את מוט ההיגוי, 5,5-דימתיל-pyrroline-N-אוקסיד, DMPO 10, DEPMPO phosphoryl-להחליף 11, אסתר, להחליף, EMPO 12 ו BMPO 13, היה בשימוש זמן רב כמו מלכודות ספין – הספין האחרון מלכודות להציג עוד מחצית חיים של O 2 • – adduct. ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) 2 </> תת הוא נפוץ ללכוד NO בשל שיעור גבוה של היווצרות adduct ויציבות גבוהה של adduct ספין 14.
השמנה EPR ספין כבר המועסקים במגוון רחב של יישומים ביו לכימות וזיהוי רדיקלים חופשיים. השמנה ספין הוא רגיש במיוחד, מסוגל לאתר רדיקלים בריכוזים הנעים בין ננומטר ל מיקרומטר ובכך מתאים ליישום במערכות ביולוגיות. היווצרות adduct פאראמגנטיים, NO-Fe 2 +-MGD, הוא הבסיס של זיהוי …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי המוסד הלאומי לבריאות הלב, ריאות ודם המכון מענק RO1 HL81248.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |