Elektron paramanyetik rezonans (EPR) spektroskopisi demir (II)-N-metil-D-glukamin ditiokarbamat, Fe (MGD) kullanılarak, insan nötrofil gelen sığır aort endotelyal hücreler ve süperoksit anyon radikal nitrik oksit tespit etmek için kullanılmıştır<sub> 2</sub> Ve 5,5-dimetil-1-pyroroline-N-oksit, sırasıyla, DMPO,.
Düşük konsantrasyonlarda reaktif nitrojen / oksijen türlerinin (ROS / RNS) sinyalizasyon, hücre fonksiyonunu düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir ve bağışıklık yanıtı ancak düzenlenmemiş konsantrasyonlarda hücre canlılığı 1, 2 için zararlıdır. Canlı sistemlerde ROS üretimi düzenleyen endojen ve diyet antioksidan savunma mekanizmaları ile büyürken, ROS normal oksijen metabolizmasının yan ürünleri doğal olarak sürekli olarak üretilir ve protein fonksiyon kaybı, DNA bölünme veya lipid sonuçlanan biyomoleküllere oksidatif hasara neden olabilir peroksidasyonu 3 ve sonuçta hücre hasarına ya da ölüme yol açan 4 oksidatif stres.
Süperoksit radikal anyonu (O 2 • -) gibi peroksinitrit ve radikal hidroksil gibi biyolojik sistemler mevcut olduğu bilinmektedir en çok oksitleyici türler bazı önemli öncüsüdür. O 2 kuşak • – dolayısıyla oksidatif patlama ilk işareti işaret ve its algılama ve / veya biyolojik sistemler sekestrasyon önemlidir. Bu gösteri de, O 2 • – polimorfonükleer nötrofiller (PMN) elde edildi. Forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile kemotaktik uyarılması yoluyla, PMN O 2 • üretir – nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz 5 aktivasyonu yoluyla.
Üç izoformları gelir nitrik oksit (NO) sentaz, indüklenebilen-, nöronal-ve endotel-NOS veya iNOS, nNOS ve eNOS, sırasıyla, NO 6 üretmek için, NADPH ile, L-sitrulin, L-arjininin dönüşüm katalize olarak . Burada, endotel hücrelerinden NO oluşturulur. Oksidatif stres koşulları altında, örneğin eNOS O 2 • NO üreten geçiş yapabilirsiniz – Heme 7 veya co-faktör, tetrahidrobiyopterin (BH 4) 8 oksidasyonu neden olduğuna inanılan ayrılmasının adı verilen bir süreç içinde.
Sadece birkaç vardırancak biyolojik sistemlerde serbest radikallerin saptanması için güvenilir yöntemler özgüllük ve duyarlılığı ile sınırlıdır. Sıkma bindirme yaygın olarak serbest radikallerin belirlenmesi için kullanılan ve elektron paramanyetik rezonans (EPR) spektroskopi ile tespit edilebilir bir kalıcı sıkma adükt oluşturan bir spin tuzağı bir radikal ilavesiyle reaksiyon kapsamaktadır. Çeşitli radikal adducts oluşturulmakta radikalleri tespit etmek ve radikal üretiminin 9 doğasına ve kinetik hakkında bilgi zenginliği sağlayabilir kullanılabilir ayırt edici spektrumu sergilemesi.
Siklik nitrones, 5,5-dimetil-pirolin-N-oksit, DMPO 10, fosforil-ikameli DEPMPO 11 ve ester-ikameli, EMPO 12 ve 13 BMPO, yaygın olarak dönme tuzağı olarak kullanılan edilmiştir – ikinci dönme adduct – tuzakları O 2 • için Uzun yarılanma ömrü sergileyerek. Demir (II)-N-metil-D-glukamin ditiokarbamat, Fe (MGD) 2 <Alt /> genel adükt oluşumu ve sıkma adükt 14 arasında yüksek stabilite yüksek oranlı NO bağlı olarak yakalamak için kullanılır.
EPR Spin hapsi serbest radikaller ve niceleme tanımlamak için biyomedikal uygulamalarda geniş bir istihdam edilmiştir. Sıkma bindirme derece hassas nM den böylece biyolojik sistemler uygulama için uygun hale uM arasında değişen konsantrasyonlarda radikalleri saptayabilir. Paramanyetik katkısı, NO-Fe 2 +-MGD, oluşumu EPR ile NO algılama temelidir. ~ Oranında 10 6 M -1 s -1 NO hızla 18 Fe 2 +-MGD tepki. NO-Fe 2 +-MGD addu…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe RO1 HL81248 tarafından finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |