Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren
Summary
Die Studie beschreibt eine kostengünstige Methode für die Identifizierung der Quelle der fäkale / Urin Kontamination oder Verunreinigung durch Nitrat in Wasser mittels qPCR für die spezifische Quantifizierung von Mensch / Schwein / Rind DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren als MST-Tools vorgeschlagen.
Abstract
Mikrobielle Kontamination der Umwelt stellt eine erhebliche Gesundheitsgefahr. Klassische bakterielle fäkalen Indikatoren haben gezeigt, dass erhebliche Einschränkungen haben, sind Viren resistenter gegen viele Inaktivierung Prozesse und Standards fäkalen Indikatoren nicht auf die Quelle der Verunreinigung zu informieren. Die Entwicklung von kosteneffizienten Methoden für die Konzentration der Viren aus dem Wasser und molekularen Assays ermöglicht die Anwendbarkeit von Viren als Indikatoren für fäkale Verunreinigungen und mikrobiellen Quelle Tracking (MST)-Tools. Adenoviren und Polyomaviren sind DNA-Viren infizieren bestimmten Wirbeltierarten einschließlich des Menschen und werden dauerhaft in Kot und / oder Urin in allen geografischen Gebieten studiert ausgeschieden. In früheren Studien, schlugen wir die Quantifizierung von humanen Adenoviren (HAdV) und JC Polyomaviren (JCPyV) durch quantitative PCR (qPCR) als Index für die menschliche fäkale Verunreinigungen. Vor kurzem haben wir qPCR-Assays für die spezifische Quantifizierung von por entwickeltcine Adenoviren (PAdV) und Rinder-Polyomaviren (BPyV) als tierische Fäkalien Marker der Kontamination mit Empfindlichkeiten von 1-10 Genom Kopien pro Reagenzglas. In dieser Studie stellen wir die Verfahren, nach dem die Quelle der Kontamination in Wasserproben mit diesen Tools zu identifizieren. Als Beispiel für repräsentative Ergebnisse, ist die Analyse der Viren im Grundwasser stellt ein hohes Maß an Nitraten gezeigt.
Nachweis von Viren in niedrig oder mäßig verschmutztes Wasser erfordert die Konzentration der Viren von mindestens mehrere Liter Wasser in einem viel kleineren Volumen, ein Verfahren, das in der Regel umfasst zwei Schritte Konzentration in Serie. Diese etwas umständliche Prozedur und die Variabilität der viralen Erholungen zu beobachten wesentlich erschweren die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Wasserproben.
Zur Beseitigung des Engpasses durch die Zwei-Schritt-Verfahren verursacht haben wir in einem Schritt-Protokoll in den vergangenen studie entwickelt beantragt haben,s und für eine Vielfalt von Wasser-Matrizen. Das Verfahren umfasst: Versauerung der Zehn-Liter-Wasser-Proben, Flockung von Magermilch, Schwerkraftsedimentation der geflockten Materialien, Sammlung des Niederschlags und Zentrifugation, Resuspension des Niederschlags in 10 ml Phosphat-Puffer. Die virale Konzentrat wird für die Extraktion von viralen Nukleinsäuren und die spezifischen Adenoviren und Polyomaviren von Interesse sind, durch qPCR quantifiziert werden. Hohe Anzahl von Proben können gleichzeitig analysiert werden mit dieser Low-Cost-Konzentration Methode.
Das Verfahren ist auf die Analyse von Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser angewendet, und bei dieser Studie präsentieren wir Ergebnisse der Analyse Grundwasserproben. Diese High-Throughput-quantitative Methode ist zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig.
Protocol
Discussion
Die beschriebene Vorgehensweise würde die Voraussetzungen für eine passende Methode für den Routineeinsatz Umwelt und öffentliche Gesundheit Laboratorien: reproduzierbar, zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig. Das Protokoll ist einfach, aber es müssen unbedingt beachtet werden. Niedrige Leitfähigkeit in den Proben ohne Zugabe von der angeforderten Konzentration von künstlichem Meerwasser Salze würden drastisch reduzieren die Wiederherstellung von Viren wie der Fall wäre, wenn die Rührzeit zur Fl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von der spanischen Regierung "Ministerio de Educación y Ciencia" (Projekt AGL2008-05275-C01/ALI) unterstützt, die von der Europäischen Union im 7. Rahmenprogramm Forschung geförderten Projekten VIROBATHE (Contract No 513648), VIROCLIME (Contract No 243923 ) und durch die Katalanische Agentur für Wasserwirtschaft, Agència Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de Control i Millora dels Ecosistemes Wassersport. Während die entwickelten Studie Marta Rusiñol war Stipendiat der katalanischen Regierung "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
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