Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células
Summary
Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.
Abstract
Os mosquitos transmitem uma série de vírus diferentes, incluindo importantes patógenos humanos, tais como vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue eo vírus chickungunya. Muitos desses vírus se intensificaram nas suas gamas endêmicas e se expandiu para novos territórios, necessitando de programas eficazes de vigilância e controle para responder a essas ameaças. Uma estratégia para monitorar a atividade do vírus envolve a coleta de um grande número de mosquitos dos locais endêmicos e testá-las para a infecção viral. Neste artigo, descrevemos como lidar, processo e tela de campo coletados mosquitos de vírus infecciosos de células Vero por ensaio de cultura. Os mosquitos são classificadas por localização armadilha e espécies, e agrupados em pools contendo ≤ 50 indivíduos. Espécimes agrupados são homogeneizados em salina tamponada com um misturador-mill ea fase aquosa é inoculada em culturas de células Vero confluentes (Clone E6). Culturas de células são monitorados para efeito citopático do dia 07/03 pós-inoculação e qualquer vírus cresceu em cultura de células são identificadas pelos testes de diagnóstico apropriado. Ao utilizar esta abordagem, temos isolados 9 tipos diferentes de vírus a partir de mosquitos coletados em Connecticut, EUA, e entre estes, cinco são conhecidos por causar doenças no homem. Três destes vírus (vírus do Nilo Ocidental, vírus Potosi e La Crosse vírus) representam novos registros para a América do Norte ou da região da Nova Inglaterra desde 1999. A capacidade de detectar uma grande diversidade de vírus é fundamental para monitoramento ambos estabelecidos e vírus emergentes na população de mosquitos.
Protocol
Discussion
Vero ensaio de cultura celular serve como um método eficaz para mosquitos tela de campo recolhidas para uma diversidade de vírus. Isto contrasta com os métodos moleculares que atingem especificamente a um ou alguns vírus de interesse. Além disso, descobrimos que ensaio de cultura de células Vero é tão ou mais sensível do que a RT-PCR 7 e fornece-nos isolados do vírus que são armazenados em nossa coleção de referência para estudos futuros. No entanto, os sistemas de cultura de células pode não …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos as importantes contribuições dos drs. John Anderson, Andrew principal e Shirley Tirrell a este estudo. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e do Departamento de Agricultura dos EUA (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).
Materials
| Name of reagent/ equipment | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Fetal bovine serum | Gibco – Invitrogen | 16140 |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco – Invitrogen | 15240 |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | Gibco – Invitrogen | 25080 |
| L-Glutamine 200mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | Gibco – Invitrogen | 11700 |
| 10X Dulbecco’s PBS | Gibco – Invitrogen | 14080 |
| Trypsin-EDTA | Gibco – Invitrogen | 15400 |
| Rabbit serum | Gibco – Invitrogen | 16120 |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353112 |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353108 |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper’s hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. . International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).
