Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero
Summary
Descriviamo un metodo per elaborare e schermo campo raccolti zanzare per una varietà di virus mediante test Vero colture cellulari. Utilizzando questa tecnica, abbiamo rilevato 9 virus diversi da 4 famiglie tassonomiche nelle zanzare raccolte nel Connecticut.
Abstract
Le zanzare trasmettono un certo numero di diversi virus tra cui importanti patogeni umani come il virus West Nile, virus dengue, virus e chickungunya. Molti di questi virus hanno intensificato nelle loro gamme endemiche e esteso a nuovi territori, che richiedono efficaci programmi di sorveglianza e di controllo per rispondere a queste minacce. Una strategia per monitorare l'attività dei virus prevede la raccolta di un gran numero di zanzare da siti endemiche e il loro test per l'infezione virale. In questo articolo viene descritto come gestire, elaborare e schermo campo raccolti per le zanzare virus infettivo mediante test Vero colture cellulari. Le zanzare sono ordinati in base alla località trappola e specie, e raggruppati in vasche contenenti ≤ 50 individui. I campioni in pool sono omogeneizzati in soluzione salina tamponata con un mixer-mulino e la fase acquosa viene inoculata in colture cellulari confluenti Vero (Clone E6). Le colture cellulari sono monitorati per effetto citopatico da 3-7 giorni post-inoculazione e qualsiasi virus coltivato in colture cellulari sono identificati dal test diagnostico appropriato. Utilizzando questo approccio, abbiamo isolato 9 virus diversi da zanzare raccolte nel Connecticut, Stati Uniti, e tra questi, 5 sono noti per causare la malattia umana. Tre di questi virus (West Nile virus, virus Potosi, e La Crosse virus) rappresentano i nuovi record per il Nord America o la regione del New England dal 1999. La capacità di rilevare un'ampia gamma di virus è fondamentale per il monitoraggio sia stabilita e virus emergenti nella popolazione di zanzare.
Protocol
Discussion
Test su cellule Vero cultura serve come un metodo efficace per lo screening sul campo raccolte zanzare per una varietà di virus. Questo contrasta con metodi molecolari che specificamente di mira uno o alcuni virus di interesse. Inoltre, abbiamo trovato che il Vero saggio coltura cellulare è altrettanto se non più sensibile di RT-PCR 7 e ci fornisce isolati di virus che sono memorizzati nella nostra collezione di riferimento per studi futuri. Tuttavia, i sistemi di coltura cellulare non può essere opportun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo con gratitudine gli importanti contributi di Drs. John Anderson, Andrew principale e Shirley Tirrell a questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni provenienti dal Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).
Materials
| Name of reagent/ equipment | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Fetal bovine serum | Gibco – Invitrogen | 16140 |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco – Invitrogen | 15240 |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | Gibco – Invitrogen | 25080 |
| L-Glutamine 200mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | Gibco – Invitrogen | 11700 |
| 10X Dulbecco’s PBS | Gibco – Invitrogen | 14080 |
| Trypsin-EDTA | Gibco – Invitrogen | 15400 |
| Rabbit serum | Gibco – Invitrogen | 16120 |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353112 |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353108 |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
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