Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar'da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon
Summary
Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.
Abstract
Birden fazla gelişimsel yolların aydınlatılmasında yol açan gen ekspresyonu manipüle etme yeteneği, günümüz deneysel embriyoloji taşıdır. Birçok güçlü ve iyi kurulmuş transgenik teknolojiler, hem kaybı ve fonksiyon-kazanç modellerinin üretimi için izin, farenin gen ekspresyon düzeyleri işlemek için kullanılabilir. Ancak, transgenik fare üretimi hem masraflı ve zaman alıcı. Bu nedenle, gen manipülasyonunun Alternatif yöntemler yaygın olarak aranmış var. Uterus içinde elektroporasyon gen teslim başarıyla 3,4 adapte olduğunu canlı fare embriyoları 1,2 içine bir yöntemdir. Bu büyük ölçüde, yaygın olarak civciv 5 kullanılan ovo elektroporasyon teknolojileri alanında başarısı üzerine dayanır. Kısaca, DNA, hücre içine DNA alımı için izin gelişmekte olan beyin ve bir elektrik akımı nedenleri, hücre zarlarında geçici gözeneklerin oluşumunu uygulama açık ventriküller içine enjekte edilir. Bizim ellerde, genç embriyoların hedefleme ultrason kılavuzluğunda mikroenjeksiyon protokol, daha önce 6 açıklanan gerektirecektir embriyolar verimli, erken embriyonik gün (E) 11,5 olarak electroporated olabilir. Tersine, E15.5 parietal ve frontal kemik farklılaşma, beyin içine mikroenjeksiyon engellemektedir başlama nedeniyle kolayca electroporate son aşamasında,. Buna karşılık, retina embriyogenezisin sonuna kadar erişilebilir. Embriyolar embriyonik ya da erken doğum sonrası dönemi boyunca, herhangi bir zaman noktasında toplanabilir. Enjeksiyon bir muhabir inşa transfekte hücreler belirlenmesini kolaylaştırır.
Bugüne kadar, utero elektroporasyon en yaygın neokortikal geliştirme 1,2,3,4 analizi için kullanılır olmuştur. Daha yeni çalışmalarda embriyonik retina 7,8,9 ve 10,11,12 talamus hedef var. Burada, bir embriyonik MSS farklı etki hedef kolayca adapte edilebilir utero elektroporasyon protokolde güncellenmiştir sunuyoruz. Biz bu tekniği kullanarak, embriyonik telencephalon, diensefalon ve retina hedef olduğunu kanıtlar. Ilk lateral ventriküller içine DNA ifade yapıları tanıtmak için bu tekniğin kullanımını gösteren, bize embriyonik telencephalon progenitör olgunlaşma, farklılaşma ve göç izlemenize olanak veren Temsilcisi sonuçları sunulmuştur. Ayrıca göç güzergâhları takip edilmesi diensefalik çekirdekleri nöronların ayırt izin vererek, bu teknik, 3. ventrikül çevresindeki diensefalik toprakları DNA hedef kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Son olarak, biz, bize retina gelişimi üzerinde gen ekspresyonu manipüle etkilerini analiz etmek izin veren, mikromanipülatörler kullanımı bize doğru subretinal alan da dahil olmak üzere küçük hedef alanlar, içine DNA yapıları tanıtmak için izin verdiğini göstermektedir.
Protocol
Discussion
In utero elektroporasyon, gelişimsel süreçlerini geniş bir yelpazede analiz etmek için kullanılır . Örneğin, GFP, mCherry veya alkali fosfataz gibi muhabir genlerin transfeksiyon soy izleme ve nöronal göç deneyler yapmak için kullanılabilir. Alternatif olarak, Cre recombinase geçici seçici floxed allel bir mekansal ve / veya geçici olarak kontrollü bir şekilde ortadan kaldırmak için ifade edilebilir. Ayrıca, shRNA veya dominant negatif yapıları demonte hedef genin fonksiyonu electroporat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar utero elektroporasyon teknoloji CS laboratuar kurulması Eva Hadzimova Pierre Mattar ve Christopher Kovaç ilk çalışma için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR) hibe (MOP 44.094) ve CS ve bir Alberta Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı Hibe DMK Takım Grant (00.933-000) Gelişmekte olan CIHR / Hazırlık Mücadele Körlük (FFB) tarafından finanse edildi. RD CIHR Kanada Umut Bursu tarafından desteklenen, RC FFB Bursu tarafından desteklenen ve LML Genetik CIHR Eğitim Grant ve Çocuk Gelişimi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
References
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
- Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
