عند العمل مع وسائل الإعلام والكواشف المستخدمة في الكائنات الحية الدقيقة الثقافة، يجب أن تمارس أسلوب العقيم لضمان أن يتم التقليل من التلوث. وتستخدم بشكل روتيني مجموعة متنوعة من الأساليب لعزل الطلاء، نشر، أو البكتيريا تعداد وبالعاثية، والتي تتضمن الإجراءات التي تحافظ على عقم المواد التجريبية.
الكائنات الدقيقة موجودة على كل الأسطح الجامدة خلق مصادر التلوث في كل مكان ممكن في المختبر. النجاح يعتمد على التجارب قدرة لتعقيم الأسطح عالم العمل والمعدات، فضلا عن منع الاتصال من الأدوات المعقمة والحلول مع الأسطح غير معقمة. هنا نقدم الخطوات لأساليب الطلاء عدة تستخدم بشكل روتيني في المختبر لعزل، نشر، أو الكائنات الحية الدقيقة تعداد مثل البكتيريا وبالعاثية. جميع الطرق الخمسة دمج تقنية العقيم، أو الإجراءات التي تحافظ على عقم المواد التجريبية. وتشمل الإجراءات المذكورة (1) خط الطلاء الثقافات البكتيرية لعزل المستعمرات واحد، (2) صب الطلاء و (3) انتشار الطلاء تعداد المستعمرات البكتيرية قابلة للحياة، (4) لينة التراكبات أجار لعزل بالعاثية و لويحات تعداد، و( 5) طبق الطلاء لنقل الخلايا من لوحة واحدة إلى آخر في نمط والمكاني متطابقة. لا يمكن أن يؤديها في هذه الإجراءات رشريطة أن مقاعد البدلاء المختبر، أنها تنطوي على غير المسببة للأمراض سلالات من الكائنات الحية الدقيقة (السلامة الأحيائية المستوى 1، BSL-1). إذا كان يعمل مع BSL-2 الكائنات، ثم يجب أن تكون هذه المناورات تجري في خزانة السلامة الأحيائية. الرجوع إلى الطبعة الأحدث من السلامة في المختبرات الميكروبيولوجية والطبية الحيوية (BMBL)، وكذلك صفائح بيانات سلامة المواد (MSDS) بالنسبة للمواد المعدية لتحديد تصنيف بيولوجية فضلا عن احتياطات السلامة والتسهيلات اللازمة لاحتواء الكائن الدقيق في السؤال. ويمكن الحصول على سلالات بكتيرية والأرصدة بالعاثية من المحققين البحوث والشركات والمجموعات التي تحتفظ بها منظمات معينة مثل مجموعة نوع الثقافة الأمريكية (ATCC). فمن المستحسن أن يتم استخدام سلالات غير ممرضة عندما تعلم أساليب الطلاء المختلفة. عن طريق اتباع الإجراءات المذكورة في هذا البروتوكول، يجب أن يكون الطلاب قادرين على:
الكائنات الدقيقة زراعة ينطوي على عدد من الطرق والطلاء، والتي تتطلب أن يتم الحفاظ تقنية العقيم طوال التلاعب من الخلايا وسائل الإعلام. وصفت خمسة إجراءات مختلفة في هذا البروتوكول. على الرغم من أن تستخدم هذه التقنيات بشكل روتيني الطلاء لمعالجة البكتيريا وبالعاثية، فإنها يمكن أيضا أن تطبق على ثقافة خلايا الثدييات والكائنات الدقيقة حقيقية النواة التي تستخدم عادة في علم الوراثة الجزيئية مثل الخميرة (أي خميرة الخباز، المبيضات البيض، السكيراء pombe)، والطحالب والبروتوزوا ( أي Volvox، المتلحفة، الأميبا، المتناعلة)، والديدان الخيطية (أي Caenorhabditis ايليجانس). هناك أيضا العديد من (وحتى أكثر تعقيدا) أشكال مختلفة من الطلاء كل أسلوب اعتمادا على الهدف التجريبية أو الكائن قيد الدراسة. وبالتالي، فمن المهم أن لا فقط تحديد الأسلوب الأكثر ملائمة لتجربة الكائنات الحية الدقيقة أو هدف معين ولكن أيضا لتكييف هذه المنهجية رقبعة نتائج تجريبية معالجة مناسبة على سؤال البحث أو المشكلة.
بعض من أكثر التطبيقات الحالية للتقنيات الطلاء التي تمت مناقشتها في هذا البروتوكول ينطوي التقدم التكنولوجي الذي تحقق الإنتاجية العالية للنتائج التجارب اكتشاف الفحص والمخدرات. على سبيل المثال، استخدام تسلسل الجينوم مراكز "أسلوب كوباكابانا" لمكتبات استنساخ انتشار الطلاء، والتي هي E. تحول الخلايا القولونية مع البلازميدات تحتوي على شظايا الحمض النووي المستمدة من الجينوم من الكائنات الحية الدقيقة. لأن يتم إعداد العشرات من لوحات كبيرة (وتسمى الصواني الأحيائي) في آن واحد، يتم استخدام لوحة شاكر الآلي لزعزعة الخرز الزجاجي للدفعة كاملة من الصواني. وعلاوة على ذلك، عند اختيار المستعمرات من هذه اللوحات بعد الحضانة، يتم استخدام منتقي مستعمرة الروبوتية لجمع الخلايا من المستعمرات حسب الاقتضاء على اللقاح للمرق LB في 384 جيدا microplates. لهذا الفحص الفرز الفائق الإنتاجية، ومبادئ الإجرائية للانتشار فتقنية أواخر تطبيق التكنولوجيا ولكن يسمح أن تتم بشكل مختلف الخطوات وتوسيع نطاقها للسماح لعدد كبير من العينات لتحليلها في وقت واحد وضمن فترة زمنية قصيرة.
التكنولوجيا الحيوية وشركات الأدوية استثمار موارد كبيرة في تطوير تكنولوجيا عالية الإنتاجية لأكثر التقنيات الأساسية في علم الأحياء المجهرية وعلم الوراثة الجزيئي. على سبيل المثال، هناك متعدد القنوات micropipettors لأداء عمليات نقل الصوت ليصل إلى 8 أو 12 عينة في وقت واحد. بل هناك محطات العمل الروبوتية التي مناورة رئيس ماصة 96-قناة! وتشمل هذه الجهود فرق متعددة التخصصات من العلماء، علماء الأحياء الاقتران التي تمتلك الخبرة المنهجية مع المهندسين ومبرمجي الكمبيوتر الذين يمكن تطوير الأجهزة اللازمة لتنفيذ العمليات الميكانيكية المرتبطة التجارب. بغض النظر عن التطبيق البحوث، والهدف المشترك من قبل شركات تطوير هذه التكنولوجيات هو نفسه – لأتمتة laboratoعمليات راي والأدوات والنظم والأدوات، مما يجعلها أقل كثافة اليد العاملة وأكثر كفاءة.
The authors have nothing to disclose.
شكر خاص لساندرز كوري في تصاميم IROC لإعداد الرسوم التوضيحية وكريس Reddi وBhairav شاه في جامعة كاليفورنيا لإنشاء نموذج الثقافات ومساعدة وأرقام. وقدمت التمويل لهذا المشروع من قبل HHMI (HHMI منحة رقم 52006944).
1. Yeast Tryptone Agar (YTA)
Yeast extract | 2.0 g |
Tryptone | 10.0 g |
Agar | 15.0 g |
Distilled water | up to 1000.0 ml |
pH 7.0 |
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.
If preparing tubes for the pour-plate procedure, allow the agar to cool to ~55°C then add 2.0 ml of 50 mg/ml cycloheximide. Aseptically dispense 18.0 ml of the melted agar per 18 mm tube then store at 4°C. The agar will solidify and will need to be melted in a steamer or microwave prior to use.
2. Minimal Salts Agar (MSA) + 0.1% (w/v) carbon source
NH4Cl | 1.0 g |
NH2HPO4•2H2O | 2.14 g |
KH2PO4 | 1.09 g |
MgSO4•7H2O | 0.2 g |
Carbon source* | 1.0 g |
Trace salts solution** | 10.0 ml |
Agar | 15.0 g |
Distilled water | up to 1000.0 ml |
pH 7.0 |
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.
* Carbon sources used for experiments presented in Figure 13 include acetamide, lactose, and glycine.
** Trace salts solution is prepared in 0.1 N HCl as follows. It is added to the base before sterilization (autoclave at 121°C for 20 minutes).
FeSO4•7H2O | 300.0 mg |
MnCl2•4H2O | 180.0 mg |
Co(NO3)2•6H2O | 130.0 mg |
ZnSO4.7H2O | 40.0 mg |
H2MoO4 | 20.0 mg |
CuSO4•5H2O | 1.0 mg |
CaCl2 | 1000.0 mg |
HCl (0.1 N) | up to 1000.0 ml |
3. EHA soft agar (0.65 % w/v)
Agar | 6.5 g | |
Tryptone | 13.0 g | |
NaCl | 8.0 g | |
Na Citrate•2H2O | 2.0 g | |
Glucose | 3.0 g | |
Distilled water | up to 1000.0 ml |
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.
4. EHA hard agar (1.2% w/v)
Agar | 12.0 g |
Tryptone | 13.0 g |
NaCl | 8.0 g |
Na Citrate•2H2O | 2.0 g |
Glucose | 3.0 g |
Distilled water | up to 1000.0 ml |
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.
5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA soft agar, 0.5% w/v)
100 mM CaCl2 stock* | 1 ml |
7H9 liquid medium: Neat ** | 50 ml |
2XTA *** | 50 ml |
Melt 50 ml of 2XTA and allow it to cool to ~55°C. Using aseptic technique, add the CaCl2 and 7H9 broth to the melted agar. Aseptically dispense 4.5 ml of the mixture per 13 mm tube and store in a 55°C incubator ≤7 days. Cooling MBTA to room temperature or 4°C will cause the CaCl2 to precipitate out of solution.
* 100 mM CaCl2. stock must be stored at room temperature to prevent CaCl2 from precipitating out of solution.
** 7H9 liquid medium: Neat
7H9 broth base | 4.7 g |
40% glycerol stock | 5 ml |
Distilled water | up to 900.0 ml |
Mix the base with water then add the glycerol while stirring. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.
*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1.0% w/v)
7H9 broth base | 4.7 g |
Agar | 1.0 g |
Distilled water | up to 1000.0 ml |
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Dispense 50 ml aliquots into 100 ml bottles and store at 4°C.
6. Middlebrook 7H10 Agar Plates (MHA hard agar, 1.9% w/v)
7H10 agar base | 19.0 g |
40% glycerol stock | 12.5 ml |
Distilled water | 887.5 ml |
Mix the agar base with water then add the glycerol while stirring. Heat the solution to boiling then stir for one minute to completely dissolve the base powder. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add the following reagents:
AD supplement (pre-warmed to 37°C)* | 100 ml |
50 mg/ml Carbenicillin ** | 1.0 ml |
10 mg/ml Cycloheximide ** | 1.0 ml |
* AD supplement
NaCl > | 17 g > |
Albumin (Fraction V)> | 100 g> |
Dextrose (D-Glucose)> | 40 g> |
Distilled water> | up to 2000.0 ml> |
Filter-sterilize this solution; do not autoclave. Store at 4°C.
** Filter-sterilize and store these solutions at 4°C for ≤60 days.
7. LB agar (1.5% w/v) + X-Gal (60 μg/ml)
Tryptone | 10.0 g |
Yeast extract | 5.0 g |
NaCl | 10.0 g |
Agar | 15.0 g |
Distilled water | up to 1000.0 ml |
pH 7.5 at 25°C |
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add 3.0 ml of 20 mg/ml X-Gal solution. Freshly prepare X-gal stock by dissolving 400 mg X-Gal in 20 ml dimethylformamide (DMF).
Table of specific reagents:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Yeast extract | Becton Dickenson | 212750 |
Tryptone | Becton Dickenson | 211705 |
Agar | Becton Dickenson | 214030 |
NH4Cl | Acros Organics | 123340010 |
NH2HPO4•2H2O | Sigma-Aldrich | 30435 |
KH2PO4 | Fisher Scientific | BP 303-500 |
MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 |
Acetamide | Sigma-Aldrich | A-0500 |
Lactose | Fisher Scientific | L6-500 |
Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 |
FeSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | F8048 |
MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M-3634 |
Co(NO3)2•6H2O | Sigma-Aldrich | 230375 |
ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 |
H2MoO4 | Acros Organics | 213621000 |
CuSO4•5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 |
HCl | Fisher Scientific | A144-212 |
Cycloheximide | Sigma | 038K1561 |
Carbenicillin | Cellgro | 46-100-RG |
NaCl | Fisher | S271-1 |
Na Citrate•2H2O | Fisher | S279-500 |
Glucose (Dextrose) | BD | 215530 |
7H9 broth base | BD | 271310 |
7H10 agar base | BD | 262710 |
Glycerol | Shelton | IB15760 |
Albumin (Fraction V) | Fisher | S71907 |
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Teknova | X1205 |
Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 |
Ethanol | Fisher | CDA19 |
Chlorine Bleach | Chlorox | 02490/06644884 |
CiDecon (disinfectant) | Decon Laboratories, Inc. | 8504 |
Table of specific equipment:
Name of equipment | Company | Catalogue number | Experiment |
Metal loops | American Educational Products | S17352 | Streak plating |
Disposable plastic loops | Fisher | 22-363-602 | Streak plating |
Wooden sticks | Fisher | 23-400-104 | Streak plating |
Flat Toothpicks | American Educational Products | S67859 | Streak plating |
Turn tables | Fisher | 08-758Q | Spread plating |
Glass rods | Bellco Glass | NC9004380 | Spread plating |
4 mm glass beads | Fisher | 11-312B | Spread plating |
Velveteen cloth | Bel-Art Products | 09-718-2 | Replica plating |
Cylindrical block | Bel-Art Products | 09-718-1 | Replica plating |