動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用
Summary
メソッドは、個別に、選択した操作、および回転するディスクの顕微鏡に結合される光トラップを使用して画像ライブの病原体に記述されています。光トラップは、生物の空間的、時間的な制御を提供し、宿主細胞にそれらが隣接して配置されます。蛍光顕微鏡は、細胞への最小限の摂動で動的な細胞間相互作用をキャプチャします。
Abstract
動的な生細胞イメージングでは、免疫システム1、2のセル間のリアルタイムの相互作用の直接可視化することができますが、食細胞と微生物との間の空間的、時間的なコントロールの欠如は、病原体に対する宿主応答の初期相互作用に焦点を当てた観測をレンダリングしている困難。歴史的に、このような貪食3のような細胞間接触のイベントは、2種類の細胞を混合することにより撮像されており、その後継続的に相互作用の適切な段階で偶然細胞間の連絡先を見つけるために視野をスキャン。これらのイベントの確率的性質は、このプロセスは面倒なレンダリング、そしてそれはこのアプローチにより、細胞間接触の初期段階やつかの間のイベントを観察することは困難です。このメソッドはしない接触の危機に瀕しているセルのペアを見つけ、そして彼らは熟達した自分の連絡先まで、それらを観察する、または必要になります。これらの制限に対処するために、我々は、培養中の細胞を配置するために非侵襲的、非破壊的ですが、迅速かつ効果的な方法として、光トラッピングを使用してください。
光トラップ、または光ピンセットは、ますます三次元4で細胞や他のミクロンサイズの粒子を捕捉し、物理的に操作するために生物学的研究に利用されています。輻射圧は、最初の観察、1970年5、6に光ピンセットシステムに適用され、1987年7生物学的標本を制御するために使用されました。それ以来、光ピンセットは、生物学的現象を8月13日の様々なプローブする技術へと成長している。
我々は進歩がとしてによって決定される宿主細胞との相互作用を促進する生理学的環境における病原性微生物の絶妙な空間的、時間的な制御を提供するために、温度と湿度が制御されているディスク共焦点顕微鏡を回転して光トラップを統合することにより、細胞のイメージングを、生きている方法14を記述する演算子。ライブ、免疫低下個体15、16（ 例えば AIDS、化学療法、および臓器移植患者）において潜在的に致命的、侵襲性感染症を引き起こす可能性カンジダおよびアスペルギルスフミガー 、、のような病原体は、光学的に隣接する非破壊レーザーの強度を使用してトラップされ、移動された病原体を貪食することができますマクロファージ、。光と蛍光ベースの動画を送信した高解像度は、生きた細胞の食作用の初期の事象を観察する能力を設立。免疫学の広範な適用性を実証するために、主要なT細胞はまた、トラップされ、in vivoでの抗CD3コーティングされたミクロスフェアとシナプスを形成する操作、およびシナプス形成のタイムラプスイメージングは、得られたれました。免疫細胞を基準にして、ライブの病原体の微細な空間的なコントロールを発揮する方法を提供することにより、細胞間相互作用は、細胞への最小限の摂動による蛍光顕微鏡で捉えることができますし、自然免疫と獲得免疫の初期応答に強力な洞察を得ることができる。
Protocol
Discussion
5μmの – 本研究では、3μmの間の寸法で病原体を捕捉する光トラップを使用してください。私たちの研究室に興味のある病原体は通常、これらの次元を持っていますが、ここで説明した光ピンセットシステムは、サイズの大きい範囲をトラップする柔軟性があります。実際に光トラップは、単一の原子から、直径約10μmの細胞に至るまでの粒子を捕捉するために使用されている。球状、楕?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、医内科ファンドのマサチューセッツ総合病院部（JMT、MKM、MLC、JMV）、生体イメージングの国立研究所と生物工学助成T32EB006348（CEC）、マサチューセッツ総合病院の計算および統合生物の開発資金のためのセンターとAI062773（によってサポートされていましたRJH）、助成金AI062773、DK83756、そしてDK 043351（RJX）、NSF 0643745（MJL）、NIH R21CA133576（MJL）、および国立衛生研究所の国立アレルギー感染病研究所（NIAID）（NIH）AI057999（JMV ）。我々は技術支援のために有用な議論をニコラスC.ユッダーに感謝、そしてチャールズフェルト（RPI社）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
References
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