Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak
Summary
Ayrı ayrı seçmek işlemek için bir yöntem tarif ve görüntü canlı patojenlerin dönen bir diskin mikroskop optik bir tuzak kullanıyor. Optik tuzak mekansal ve zamansal organizmaların kontrolü sağlar ve konak hücrelerine onları komşu yerleştirir. Floresan mikroskopi hücrelere az pertürbasyon dinamik hücrelerarası etkileşimleri yakalar.
Abstract
Dinamik canlı hücre görüntüleme, bağışıklık sistemi 1, 2 hücreleri arasında gerçek zamanlı etkileşim doğrudan görselleştirme sağlar; Ancak, fagositik hücre ve mikrop arasındaki mekansal ve zamansal kontrol eksikliği patojenlere karşı konak yanıtının ilk etkileşimler içine gözlemler odaklı hale getirdi zordur. Tarihsel olarak, hücrelerarası kişi olaylarının fagositoz 3 gibi iki hücre tipleri karıştırma imaged ve sonra sürekli etkileşim uygun aşamada serendipitous hücrelerarası kişileri bulmak için tarama alan görünümü. Bu olayların stokastik bu sürecin doğa sıkıcı işler ve bu yaklaşım, erken ya da hücre-hücre teması kısacık olaylar gözlemlemek zordur. Bu yöntemi, temas eşiğinde hücre çiftleri bulma ve onlar erdirmek onların iletişim kadar onları gözlemleyerek gerektirir, ya da yoktur. Bu sınırlamaları aşması için, hücre kültürü yerleştirmek için bir non-invaziv, yıkıcı olmayan, ancak hızlı ve etkili bir yöntem olarak optik yakalama kullanın.
Optik tuzaklar, ya da optik cımbız, giderek, hücre ve diğer mikron boyutlu parçacıklar üç boyutlu 4 yakalama ve fiziksel olarak manipüle biyolojik araştırmalarda kullanılmaktadır. Radyasyon basıncı ilk gözlenen ve 1970 5, 6, optik cımbız sistemleri uygulanan ve ilk kez 1987 7 biyolojik örneklerin kontrol etmek için kullanılmıştır. O zamandan beri, çeşitli biyolojik olgunun 8-13 prob optik cımbız bir teknoloji haline gelmişti.
Biz gelişmeler, optik bir tuzak olarak belirlenen ana hücreleri ile etkileşimleri kolaylaştırmak için fizyolojik bir ortamda patojen organizmaların nefis mekansal ve zamansal kontrol sağlamak için sıcaklık ve nem kontrolü ile disk konfokal mikroskopi iplik ile entegre ederek hücre görüntüleme canlı bir yöntem 14 tarif operatörü. Canlı, immün sistemi baskılanmış bireyler 15, 16 (örneğin AIDS, kemoterapi, ve organ nakli), potansiyel olarak ölümcül, invaziv enfeksiyonlara neden Candida albicans ve Aspergillus, patojen organizmalar gibi optik bitişik tahribatsız lazer yoğunlukları kullanılarak yakalanmış ve taşındı makrofajlar, patojen fagosite. Yüksek çözünürlük, ışık ve floresan tabanlı filmler iletilen canlı hücreler fagositoz erken olayları gözlemleme yeteneği kurulmuştur. Immünoloji geniş uygulanabilirliğini göstermek için, birincil T-hücrelerinin sıkışıp kalmasına ve in vivo anti-CD3 kaplı mikrosferler ile sinaps oluşturmak için manipüle ve sinaps oluşumu zaman atlamalı görüntü de elde edildi. Canlı patojenlerin bağışıklık sistemi hücrelerine göre ince mekansal kontrolü uygulamak için bir yöntem sağlayarak, hücresel etkileşimler hücrelere az pertürbasyon floresan mikroskobu ile yakalanan ve güçlü bir anlayış doğal ve adaptif bağışıklık erken cevaplar verebilmesidir.
Protocol
Discussion
– 5 mikron Bu çalışmada, 3 mikron arasında boyutları ile patojenler yakalamak için optik bir tuzak. Laboratuara ilgi patojenler genellikle bu boyutları olsa da, burada açıklanan optik cımbız sistemi, boyutları çok geniş bir yelpazede yakalamak için esnek. Aslında optik tuzakları tek atomdan hücreleri çapı yaklaşık 10 mikron arasında değişen partiküller yakalamak için kullanılmıştır. Küresel, eliptik ve biyolojik patojenler ile çalışırken yararlı çok uzamış parçacıklar: Ayrıca, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Tıp İç Fonları Massachusetts Genel Hastanesi Bölümü (JMT, MKM, MLC, JMV) Ulusal Biyomedikal Görüntüleme Enstitüsü ve Biyomühendislik hibe T32EB006348 (MSK), Massachusetts Genel Hastanesi Kullanıcı Hesaplamalı ve Bütünleştirici Biyoloji geliştirme fonu için Merkezi ve AI062773 (tarafından desteklenen oldu RJH), hibe AI062773, DK83756 ve DK 043.351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV .) Nicholas C. Yoder teknik yardım için yararlı tartışmalar için teşekkür eder, ve Charles Keçeler (RPI, Inc.)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
References
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
