根切断術後の後根の軸索のライブイメージング
Summary
アン<em> in vivoで</em後根の粉砕は、次の一次感覚軸索を監視する>イメージングプロトコルが記述されています。手順は、広視野蛍光顕微鏡とTHY1 – YFPトランスジェニックマウスを利用し、CNSのインタフェースを持つPNSと軸索の相互作用が4cm以上の軸索再生の繰り返しイメージングを可能にする。
Abstract
脊髄神経根の損傷によって負傷した一次感覚軸索は、慢性的な痛みや永続的な感覚消失につながる、脊髄に再生に失敗する。脊髄への後根（DR）軸索の再生が後根エントリゾーン（DREZ）、CNSとPNSの間の界面で阻止される。神経損傷に関連する複雑な変更は事後解析から推定されているためDREZで再生を防止する分子や細胞のイベントの我々の理解は、部分的に、不完全です。このような軸索再生のようなダイナミックな細胞プロセスは、、最高の各生きている動物の複数の観測値とのリアルタイムイベントをキャプチャするテクニックを研究しています。 生体内で連続的にニューロンを監視するために我々の能力は、光学系およびマウス遺伝子組換えの革新的な技術革新に起因し飛躍的に増加している。 THY1 – GFPトランスジェニックマウスの数行は、神経細胞のサブセットを遺伝的に異なる蛍光色でラベル付けされている、個々の神経細胞がインビボ 1 で撮像される許可。これらのマウスは、筋肉の2-4と5月7日脳のin vivoイメージングのために広く使用されており、静的解析が解決していないことを生理学的メカニズムに新たな洞察を提供している。生きている脊髄の神経細胞のイメージング研究では、ごく最近になって始めている。リヒトマンと彼の同僚は、最初のワイド視野顕微鏡8,9で負傷した脊柱（DC）軸索を追跡することによって、その実現可能性を示した。深くに位置するDCの軸索のin vivoイメージング多光子、ミクログリアと血管はまた10を達成している。過去数年間、我々は広視野顕微鏡とTHY1 – YFPマウスのHのラインを使用してDRの軸索の再生を監視するためのin vivoイメージングに適用することに先駆けて。これらの研究は、DRの軸索は、脊髄11内に再生成が禁止されている理由についての小説仮説に私たちを導いた。
THY1 – YFPマウスのHラインでは、別個のYFP +軸索は、表面的にいくつかの軸索を同時に監視できるようになる、配置されている。我々はDREZに到着DRの軸索がより頸髄よりも腰椎でイメージングされたことを知りました。本報告では、我々は再生成DRの軸索の成功を長期的かつ繰り返しイメージングを確保するために有用な発見したいくつかの戦略を説明します。これらは、繰り返し挿管と呼吸の中断をなくす手術に伴うストレスや瘢痕形成を最小限にし、光毒性なしに高分解能で安定した画像を取り込む方法が挙げられる。
Protocol
Discussion
それはその後のイメージングセッションで複数の手術侵襲と麻酔薬の手続きが続く広範囲に軸索の成長を監視するためにかなりの背側椎弓切除を必要とするため、直接生きているマウスのイメージングDR再生は特に困難である。いくつかの戦略は、これらの課題を克服する助け。最初に、成功したイメージングは、麻酔や出血の持続期間を最小限に抑えることにより、マウスの死亡率を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、コメントと編集のヘルプは博士アランテスラーに感謝。この作品は、NIH NS062320によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
