一个<em>在体内</em>成像监测初级感觉神经轴突,背根粉碎后的协议描述。该程序利用宽视场荧光显微镜和thy1 – YFP转基因小鼠,并允许超过4厘米的期票,与中枢神经系统的接口轴突的相互作用反复轴突再生的成像。
根脊髓受伤受伤的初级感觉神经轴突无法再生进入脊髓,导致慢性疼痛和永久的感觉丧失。到脊髓的背根(DR)的轴突再生,防止背根进入区(DREZ),CNS和PNS之间的接口。我们理解的分子和细胞活动,防止再生DREZ,是不完整的部分,因为已经从事后分析,推导出了复杂的变化与神经损伤有关。细胞的动态过程,如轴突再生,是最好的研究与技术,捕捉每一个活生生的动物的多个观测的实时事件。我们体内连续监测神经元的能力已大大增加,由于在光学和转基因小鼠的革命性的创新。 thy1 GFP转基因小鼠的几行,在神经细胞亚群的基因在不同的荧光色标记,允许单个神经元 在体内1成像。这些老鼠已经广泛使用在体内的肌肉2-4和大脑5-7成像,到生理机制提供了新颖的,不可能解决静态分析的见解。最近才开始的生活脊髓中的神经元的成像研究。李奇曼和他的同事们第一次证明了跟踪受伤的背柱(DC)的轴突, 宽视场显微镜8,9了其可行性。多光子深深定位的直流轴突在体内成像,小胶质细胞和血管也已经完成 10 。在过去的几年中,我们已率先应用在活体成像监测的DR采用宽视场显微镜和H thy1 – YFP小鼠轴突再生。这些研究,使我们以一个新颖的假说为什么DR轴突再生防止脊髓内的11。
在H线thy1 – YFP的小鼠,不同的YFP +轴突是表面上的位置,可以同时监控几个轴突。我们已经了解到,博士轴突到达在DREZ更好的成像比在脊髓型颈椎病,腰。在本报告中,我们描述了,我们已经找到有用的,以确保成功的长期和反复轴突再生DR成像的几种策略。这些措施包括消除重复插管和呼吸中断的方法,最大限度地减少手术相关的压力和瘢痕形成,并获得稳定的图像分辨率高,没有光毒性。
成像DR直接在活老鼠再生,是特别具有挑战性的,因为它需要大量的背椎板切除,监察多个微创手术和麻醉的程序,在随后的成像会话广域轴突的生长。几种策略帮助克服这些挑战。首先,成功的成像要求减少麻醉和出血时间,降低小鼠的死亡率(约25%),并通过细致的术后护理。死亡率也减少了使用,允许快速的摄像头的速度快速采集多个图像,无需插管或呼吸中断设置。上外露的电源线防止…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢阿兰泰斯勒博士评论和社论帮助。这项工作是由NIH NS062320支持。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |