Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy
Summary
Een<em> In vivo</em> Imaging-protocol om de primaire sensorische axonen volgende achterwortelganglia verpletteren monitor is beschreven. De procedures maken gebruik van wide-field fluorescentie microscopie en thy1-YFP transgene muizen, en staan herhaalde beeldvorming van regeneratie van axonen meer dan 4 cm in de PNS en axon interacties met de interface van het CZS.
Abstract
De primaire sensorische axonen gewond door spinale wortel verwondingen niet te regenereren in het ruggenmerg, wat leidt tot chronische pijn en blijvende zintuiglijke verlies. Regeneratie van dorsale wortel (DR) axonen in het ruggenmerg wordt voorkomen op de dorsale wortel entry zone (DREZ), de interface tussen het centrale zenuwstelsel en PNS. Ons begrip van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die regeneratie te voorkomen op DREZ is onvolledig, deels omdat complexe veranderingen die gepaard gaan met een zenuwbeschadiging zijn afgeleid uit post-mortem analyses. Dynamische cellulaire processen, zoals regeneratie van axonen, worden het best bestudeerd met technieken die real-time gebeurtenissen met meerdere waarnemingen van ieder levend dier te vangen. Ons vermogen om neuronen te controleren serieel in vivo is dramatisch toe als gevolg van revolutionaire innovaties in de optica en de muis genetische manipulatie. Verscheidene lijnen van thy1-GFP transgene muizen, waarin de subsets van neuronen genetisch zijn geëtiketteerd in verschillende fluorescerende kleuren, maken individuele neuronen af te beelden in vivo 1. Deze muizen zijn uitgebreid gebruikt voor in vivo beeldvorming van de hersenen de spieren 2-4 en 5-7, en hebben nieuwe inzichten in de fysiologische mechanismen die statische analyses niet konden hebben opgelost. Beeldvormend onderzoek van neuronen in het ruggenmerg wonen nog maar kort geleden begonnen. Lichtman en zijn collega's voor het eerst gedemonstreerd op hun haalbaarheid door het bijhouden van gewonde dorsale kolom (DC) axonen met een wide-field microscopie 8,9. Multi-foton in vivo beeldvorming van diep gepositioneerd DC axonen, heeft microglia en bloedvaten ook bereikt 10. In de afgelopen jaren, hebben wij de pioniers bij de toepassing van in vivo beeldvorming tot regeneratie van axonen DR gebruik van wide-field microscopie en H lijn van thy1-YFP muizen monitor. Deze studies hebben geleid tot een nieuwe hypothese over de reden waarom DR axonen worden verhinderd regenereren in het ruggenmerg 11.
In H lijn van thy1-YFP muizen, zijn te onderscheiden YFP + axonen oppervlakkig geplaatst, die het mogelijk maakt meerdere axonen tegelijk worden gecontroleerd. We hebben geleerd dat DR axonen te komen tot DREZ beter worden afgebeeld in de lumbale dan in cervicale ruggenmerg. In dit rapport beschrijven we een aantal strategieën die we hebben gevonden nuttig om een succesvolle lange termijn en herhaalde beeldvorming van regenererende axonen DR verzekeren. Deze omvatten methoden die herhaald intubatie en respiratoire onderbreking elimineren, minimaliseren van de operatie-geassocieerde stress en littekenvorming, en het verwerven van een stabiele beelden op hoge resolutie zonder fototoxiciteit.
Protocol
Discussion
Imaging DR regeneratie direct in levende muizen vormt een bijzondere uitdaging, omdat het een substantiële dorsale laminectomie nodig heeft om axongroei monitoren over een groot gebied, gevolgd door meerdere invasieve chirurgische en anesthetische procedures in de daaropvolgende beeldvorming sessies. Verschillende strategieën geholpen om deze uitdagingen te overwinnen. De eerste, succesvolle beeldvormend onderzoek vereist het verminderen van de muis de mortaliteit (circa 25%) door het minimaliseren van de duur van de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Alan Tessler voor commentaar en redactionele hulp. Dit werk werd ondersteund door NIH NS062320.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
