Steigende cDNA Erträge aus Einzel-Zell-Mengen von mRNA in Standard Laboratory Reverse-Transkriptase-Reaktionen mit Acoustic Microstreaming
Summary
Wir beschreiben ein neuartiges Verfahren zur Erhöhung der cDNA-Ausbeute von Single-Cell-Mengen von mRNA in sonst üblichen Labor reverse Transkription Reaktionen. Die Neuheit besteht in der Verwendung von einem Mikromischer, die das Phänomen der akustischen Microstreaming nutzt, um Flüssigkeiten bei Mikroliter Skalen effektiver Mix als Schütteln, Vortexen oder Verreibung.
Abstract
Die Korrelation der Genexpression mit Zellverhalten ist ideal an den Single-Cell-Ebene getan. Dies ist jedoch nicht leicht zu erreichen, weil die geringe Menge an labile mRNA in einer einzigen Zelle (1-5% der 1-50pg Gesamt-RNA oder 0,01-2.5pg mRNA, pro Zelle 1) meist abbaut, bevor sie transkribiert werden rückgängig machen kann in eine stabile cDNA-Kopie. Zum Beispiel unter Verwendung von Standard-Labor Reagenzien und Hardware können nur eine kleine Anzahl von Genen qualitativ pro Zelle 2 bewertet. Eine Möglichkeit, die Effizienz der Standard-Labor-Reverse-Transkriptase (RT)-Reaktionen (zB Standard-Reagenzien in mikrolitergroßen) mit Single-Cell-Mengen von mRNA zu erhöhen wäre, schneller zu mischen Reagenzien, so dass die mRNA in cDNA umgewandelt werden können, bevor es abgebaut wird. Dies ist jedoch nicht trivial, weil bei Mikroliter Flüssigkeit Skalen Strömung laminar, dh derzeit verfügbaren Methoden der Durchmischung (dh Zittern, Vortexen und Verreibung) nicht genügend chaotische Bewegung effektiv Reagenzien zu produzieren. Um dieses Problem zu lösen, haben Mikro-Maßstab Mischtechniken verwendet 3,4 sein. Eine Reihe von mikrofluidischen-basierte Misch-Technologien entwickelt worden, die erfolgreich erhöhen RT Reaktionsausbeuten 5-8. Allerdings erfordern Mikrofluidik-Technologien spezialisierte Hardware, die relativ teuer und noch nicht allgemein verfügbar ist. Eine billigere, bequemere Lösung ist wünschenswert. Das Hauptziel dieser Studie ist es zu demonstrieren, wie Einsatz eines neuartigen "Mikrovermischung" Technik, um Standard-Labor-RT-Reaktionen mit Single-Cell-Mengen von mRNA signifikant erhöht ihre cDNA ergibt. Wir finden cDNA Erträge um etwa 10 bis 100-fache, die ermöglicht zu erhöhen: (1) eine größere Anzahl von Genen pro Zelle analysiert werden, (2) mehr quantitative Analyse der Genexpression, und (3) eine bessere Erkennung von Low-Fülle Gene in einzelnen Zellen. Die Mikrovermischung auf akustische Microstreaming 9-12, ein Phänomen, wo die Schallwellen ausbreiten um ein kleines Hindernis zu schaffen eine mittlere Strömung in der Nähe des Hindernisses auf. Wir haben eine akustische Microstreaming-basierten Gerät ("Mikromischer") mit einer Schlüssellänge Vereinfachung entwickelt, akustische Microstreaming kann bei Audio-Frequenzen, indem sichergestellt wird das System über einen Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle mit einem kleinen Krümmungsradius 13 erreicht werden. Der Meniskus einer Mikroliter Volumen der Lösung in einer Röhre bietet eine entsprechend kleinen Krümmungsradius. Die Verwendung von Audio-Frequenzen bedeutet, dass die Hardware kann kostengünstig und vielseitig 13 und Nukleinsäuren und anderen biochemischen Reagenzien dürfen nicht beschädigt sein, wie sie mit Standard-Labor sonicators werden kann.
Protocol
Discussion
Die Methode der Anwendung von Mikrovermischung Standard-Labor-RT hier beschriebenen Reaktionen kann natürlich beinhalten mRNA geerntet über einen beliebigen Methode (zB Zell-Lyse-, Laser-Mikrodissektion). Es kann auch eine beliebige Marken oder Typen von RT-Reagenzien, bei jeder Temperatur (innerhalb der Toleranz von den Materialien der Mikromischer) und einen beliebigen Zeitraum. Zum Beispiel haben wir eine verbesserte cDNA Erträge aus RT-Reaktionen mit random Hexamer oder Oligo-dT-Primer beobachtet. Es könnte auch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Health and Medical Research Council of Australia (Projekt Grant No. 6288480) und der Scobie und Clare MacKinnon Trust unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus, CA, USA | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega | C1181 | |
| AMV-RT | Promega | M5101 | |
| dNTP set | Promega | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Scientific | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
- Livesey, F. J. Brief Funct Genomic Proteomic. 2 (1), 31-31 (2003).
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. . Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. . Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. . J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. . Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. . Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. . Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. . Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O’Hara, M. J., Peper, S. M. . Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. a. b. . 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. . 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. . 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. . Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N. Ann Rev Fluid Mech. 33, 43-43 (2001).
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. . Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
