Aumentar el rendimiento de cDNA a partir de una sola célula cantidades de ARNm en las reacciones de laboratorio estándar de la transcriptasa inversa con microcorrientes acústica

Summary

Se describe un nuevo método para aumentar el rendimiento de cDNA a partir de una sola célula cantidades de ARNm en las reacciones de laboratorio estándar de lo contrario la transcripción inversa. La novedad reside en el uso de un micromixer, que utiliza el fenómeno de las microcorrientes acústica, para mezclar líquidos a escalas microlitro con más eficacia que temblores, agitación o trituración.

Abstract

La correlación de la expresión génica con el comportamiento celular está muy bien hecho a nivel de una sola célula. Sin embargo, esto no es fácil de lograr debido a que la pequeña cantidad de ARNm lábil presente en una sola célula (1-5% de 1-50pg ARN total, o ARNm de 0,01 2.5pg, por celda ¹⁾ en su mayoría se degrada antes de que se transcriben de forma inversa en una copia de cDNA estable. Por ejemplo, utilizando reactivos de laboratorio y de hardware, sólo un pequeño número de genes pueden ser evaluadas cualitativamente por la celda ^2. Una forma de aumentar la eficiencia de los métodos de laboratorio de la transcriptasa inversa (RT), las reacciones (es decir, los reactivos estándar en los volúmenes de microlitros) que comprende una sola célula cantidades de ARNm sería confundir más rápidamente los reactivos para el ARNm puede ser convertido a cDNA antes de que se degrada. Sin embargo, esto no es trivial, ya que a escalas microlitro de flujo de líquido es laminar, es decir, los métodos actualmente disponibles de la mezcla (es decir, temblores, agitación y trituración) no produce un movimiento caótico suficiente para mezclar con eficacia los reactivos. Para resolver este problema, micro-escala de técnicas de mezcla que se utilizará ^3,4. Una serie de microfluidos tecnologías basadas en la mezcla, se han desarrollado con éxito aumentar el rendimiento de la reacción RT ^8.5. Sin embargo, las tecnologías de microfluidos requieren hardware especializado que es relativamente caro y que aún no están ampliamente disponibles. Una solución más barata, más cómoda es deseable. El objetivo principal de este estudio es demostrar cómo la aplicación de una novela "micromezcla" técnica estándar de laboratorio las reacciones de RT que comprende una sola célula cantidades de ARNm aumenta significativamente el rendimiento de sus ADNc. Nos encontramos con los rendimientos de cDNA un aumento de aproximadamente 10 a 100 veces, lo que permite: (1) un mayor número de genes a ser analizados por la célula, (2) análisis cuantitativo de la expresión génica, y (3) una mejor detección de los genes de baja abundancia en las células individuales. El micromezcla se basa en acústico microcorrientes ^12.09, un fenómeno por el cual las ondas de sonido alrededor de propagación de un pequeño obstáculo crear un flujo promedio cerca del obstáculo. Hemos desarrollado una acústica microcorrientes dispositivo basado en ("micromixer"), con una simplificación clave; microcorrientes acústica se puede conseguir en las frecuencias de audio, asegurando que el sistema tiene una interfase líquido-aire con un pequeño radio de curvatura ^13. El menisco de un volumen de microlitro de solución en un tubo ofrece un radio de curvatura apropiado pequeños. El uso de las frecuencias de audio significa que el hardware puede ser barato y versátil ^13, y los ácidos nucleicos y otros reactivos bioquímicos no son dañados como pueden ser con sonicadores estándar de laboratorio.

Protocol

1. Micromezcla una reacción RT Antes de realizar una reacción de RT con micromezcla, equilibrar la micromixer a la temperatura deseada de la reacción de RT. Coloque el micromixer dentro de 37 ° C (o la temperatura recomendada por el proveedor RT) incubadora de al menos 1 hora antes del inicio de la reacción de RT. Establecer la mezcla de RT de acuerdo con el proveedor de la transcriptasa inversa de (por ejemplo, MMTV-RT de Promega, Omniscript de Qiagen) instrucciones, excepto…

Discussion

El método de aplicación de micromezcla a métodos de laboratorio las reacciones de RT descritos aquí pueden, por supuesto, implica ARNm cosechado a través de cualquier método (por ejemplo, células de lisis, láser microdisección de captura). También puede comprender cualquiera de las marcas o tipos de reactivos RT, cualquier temperatura (dentro de la tolerancia de los materiales de la micromixer), y cualquier período de tiempo. Por ejemplo, hemos observado que mejora los rendimientos de cDNA a partir de las rea…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus, CA, USA	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega	C1181
AMV-RT	Promega	M5101
dNTP set	Promega	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111
Nuclease-Free Water	Promega	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystem	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Scientific
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008