تجارب أداء مخصص ميكروأري MicroRNA
Summary
ووصف الإجراء بسيطة مخصصة لأداء التجارب ميكروأري microRNA. وتشمل الخطوات عزل الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي العلامات المرجعية ، التهجين العينات الى ميكروأرس ، ميكروأرس مسح وقياس الاشارات التهجين.
Abstract
microRNAs (miRNAs) هي عائلة كبيرة من النيوكليوتيدات 22 ~ (الإقليم الشمالي) لفترة طويلة جزيئات الحمض النووي الريبي التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع في حقيقيات النوى 1. الجينوم المعقدة ترميز ما لا يقل عن مئات miRNAs ، التي تمنع في المقام الأول على التعبير عن عدد كبير من الجينات المستهدفة بعد transcriptionally 2 ، 3. miRNAs تحكم طائفة واسعة من العمليات البيولوجية 1. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط تغيير التعبير ميرنا مع الأمراض التي تصيب الإنسان مثل أمراض السرطان وmiRNAs قد تكون بمثابة المؤشرات الحيوية للأمراض والتشخيص 4 ، 5. من المهم ، لذلك ، لفهم التعبير وظائف miRNAs في ظل ظروف عديدة ومختلفة.
وقد استخدمت ثلاثة أساليب رئيسية للتعبير ميرنا ل : في الوقت الحقيقي PCR ، ميكروأري ، وتسلسل عميق. تقنية ميكروأري ميرنا وتتميز بأنها عالية الإنتاجية ، وعموما أقل تكلفة ، والأكثر من الخطوات التجريبية والتحليل يمكن كارالعبوات الناسفة في مختبر البيولوجيا الجزيئية في معظم الجامعات والمدارس والمستشفيات الطبية المرتبطة بها. هنا ، نحن تصف طريقة مخصصة لأداء التجارب ميكروأري ميرنا. ستتم طباعة مجموعة التحقيق ميرنا على الشرائح الزجاجية لإنتاج ميكروأرس ميرنا. يتم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام أسلوب أو كاشف يحافظ على الأنواع الصغيرة RNA ، وصفت بعد ذلك مع صبغة مضان. كعنصر تحكم ، وصفت أيضا الحمض النووي [أليغنوكليوتيد] إشارة المقابلة إلى مجموعة فرعية من miRNAs مع صبغة مضان مختلفة. والحمض النووي المرجعية خدمة للتدليل على نوعية الشريحة والتهجين وستستخدم أيضا للتطبيع البيانات. تختلط RNA والحمض النووي والمهجنة إلى شريحة تحتوي على ميكروأري تحقيقات لمعظم miRNAs في قاعدة البيانات. بعد الغسيل ، ويتم تفحص الشريحة للحصول على الصور ، وكميا كثافة من البقع الفردية. وسيتم تجهيز هذه الإشارات الخام وتحليلها وكذلك البيانات تعبيرا عن miRNAs المقابلة. Microaيمكن جرد الشرائح rray ومجدد للحد من تكلفة ميكروأرس وتعزيز اتساق التجارب ميكروأري. نفس المبادئ وإجراءات قابلة للتطبيق على أنواع أخرى من التجارب ميكروأري مخصص.
Protocol
Discussion
فعلى الرغم من التطورات الأخيرة في تقنيات التسلسل عميق ، ميكروأري يظل خيارا صالحا لتحليل إنتاجية عالية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. مقارنة تسلسل عميق ، والتجارب ميكروأري أرخص ، ومختبر البيولوجيا الجزيئية نموذجية يمكن تنفيذ معظم التجارب وتحليل البيانات في ا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد العمل في جزء من المعهد الوطني لتعاطي المخدرات مركز (P50 DA 011806) وجيش الولايات المتحدة وزارة الدفاع (W81XWH – 07 – 1 – 0183).
Materials
| Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
References
- Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. miRNAs in human cancer. J. Pathol. 223, 102-115 (2011).
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
