Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

Summary

Un procedimiento sencillo de llevar a cabo experimentos de microarrays de encargo de microARN se describe. Los pasos incluyen el aislamiento de ARN, el ARN y el ADN de referencia el etiquetado, la hibridación de las muestras de microarrays, el escaneado de los microarrays, cuantificar y analizar las señales de hibridación.

Abstract

microARN (miRNA) son una gran familia de ~ 22 nucleótidos (nt) de longitud moléculas de ARN que se expresan ampliamente en las células eucariotas ^1. Genomas complejos codifican por lo menos cientos de miRNAs, que sobre todo inhibir la expresión de un gran número de genes diana transcripcional después de ^{2, 3.} miRNAs control de una amplia gama de procesos biológicos ^1. Además, la expresión alterada miRNA se ha asociado con enfermedades humanas como el cáncer, y los miRNAs pueden servir como biomarcadores de enfermedades y el pronóstico ^{4, 5.} Es importante, por lo tanto, para entender la expresión y función de los miRNAs en diferentes condiciones.

Tres enfoques principales han sido empleados para el perfil de expresión de miARN: PCR en tiempo real, de microarrays, secuenciación y profundidad. La técnica de los microarrays de miRNA tiene la ventaja de ser de alto rendimiento, en general, menos costoso, y la mayoría de las medidas experimentales y el análisis puede ser carrIED en un laboratorio de biología molecular en la mayoría de las universidades, escuelas médicas y hospitales asociados. Aquí se describe un método para realizar experimentos de microarrays de encargo miRNA. Una sonda conjunto miRNA se imprimirán en láminas de vidrio para producir microarrays miRNA. El ARN es aislado utilizando un método o reactivo que preserva las especies pequeñas de ARN, y marcado con un colorante fluorescente. Como control, los oligonucleótidos de ADN de referencia que corresponde a un subconjunto de miRNAs están marcados con un colorante fluorescente diferente. El ADN de referencia servirá para demostrar la calidad de la diapositiva y la hibridación y también se utiliza para la normalización de datos. El ARN y el ADN se mezclan y se hibridó con una diapositiva que contiene sondas de microarrays para la mayoría de los miRNAs en la base de datos. Después del lavado, la diapositiva se escanea para obtener imágenes y cuantificar la intensidad de los puntos individuales. Estas señales en bruto será procesada y analizada, los datos de expresión de los miRNAs correspondiente. MicroArray diapositivas se puede eliminar y se regenera para reducir el costo de microarrays y de mejorar la coherencia de experimentos de microarrays. Los mismos principios y procedimientos son aplicables a otros tipos de experimentos de microarrays personalizados.

Protocol

1. La impresión de microarrays miARN personalizado Imprimir los microarrays diapositivas con los servicios básicos de microarrays instalaciones de una universidad o una empresa. La calidad de fabricación de microarrays es uno de los factores más críticos para el éxito de un experimento de microarrays. Pruebe algunos de los servicios si es posible. Lo ideal sería imprimir 50-100 diapositivas a la vez, y todas las diapositivas se ven idénticas, con buena separación, los puntos individuales. P…

Discussion

A pesar de los avances recientes en profundidad las tecnologías de secuenciación, microarrays sigue siendo una opción viable de alto rendimiento para el análisis de ADN y ARN. En comparación con la secuenciación de profundidad, los experimentos de microarrays son más baratos, y un laboratorio típico de la biología molecular puede realizar la mayoría de los experimentos y análisis de datos in-house, que permite flexibilidad y ahorro de tiempo. En el futuro, es probable microarrays bien adaptado para interrogar…

Materials

Items	Vendor	Catalogue number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo/Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent