Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux)

Summary

Se describe un método alternativo para la enumeración de las micobacterias<em> In vitro</em>, Que utiliza el reportero de genes etiquetados micobacterias en lugar de unidades formadoras de colonias (UFC). "Survival" de los organismos así como el anfitrión de respuesta se miden los marcadores simultáneamente, proporcionando un bajo costo, un sistema versátil y funcional para el estudio de las interacciones hospedante / patógeno en el contexto de la tuberculosis.

Abstract

Ensayos funcionales han desempeñado un papel clave en la medición de la inmunogenicidad de una vacuna administrada. Esto se expresa convencionalmente como suero títulos bactericidas. Los estudios de títulos bactericidas séricos en respuesta a las vacunas infantiles nos han permitido desarrollar y validar niveles de corte de la respuesta inmunitaria protectora y como corte-offs son de uso rutinario. No hay tales pruebas se han llevado adelante en la evaluación de rutina de las vacunas que inducen principalmente inmunidad mediada por células en forma de respuestas de células T efectoras, tales como vacunas contra la tuberculosis. En el modelo animal, el rendimiento de un candidato a vacuna dada es evaluada en forma rutinaria en los ensayos normalizados bactericida, y todos los actuales nueva vacuna contra la tuberculosis, los candidatos han sido sometidos a este paso en su evaluación antes de la fase 1 de ensayos humanos. La evaluación de la inmunogenicidad y por lo tanto, la probabilidad de eficacia protectora de la novela de vacunas contra la tuberculosis idealmente deben ser sometidos a un similar paso a paso la evaluación de los modelos humanos ahora, incluyendo las mediciones en los ensayos de bactericidas.

Ensayos bactericidas en el contexto de la investigación sobre la tuberculosis vacuna ya están bien establecidos en los modelos animales, donde se aplican a la pantalla de vacunas potencialmente prometedores. La reducción de la carga bacteriana en las funciones de varios órganos como la principal lectura de la inmunogenicidad. Sin embargo, estos ensayos no han sido incorporados en los ensayos clínicos de nuevas vacunas contra la tuberculosis hasta la fecha.

Aunque todavía hay incertidumbre sobre los mecanismos exactos que llevan a la muerte de las micobacterias interior de los macrófagos humanos, la interacción de los macrófagos y las células T con micobacterias es claramente necesario. El ensayo se describe en este documento representa una generación nueva de ensayos bactericidas que permite a los estudios de estos componentes celulares claves con todos los demás factores humorales y celulares presentes en la sangre entera sin hacer suposiciones acerca de su contribución individual relativa. El ensayo descrito por nuestro grupo utiliza pequeños volúmenes de sangre total y ya ha sido empleado en los estudios de adultos y niños en las zonas endémicas de TB-configuración. Hemos demostrado la inmunogenicidad de la vacuna BCG, un mayor crecimiento de las micobacterias en pacientes VIH-positivos, así como el efecto de la terapia anti-retroviral y la vitamina D en la supervivencia de micobacterias in vitro. Aquí un resumen de la metodología, y presentar nuestros datos de reproducibilidad utilizando este modelo relativamente simple, de bajo costo y el campo de usar.

Nota: Las definiciones / abreviaturas

BCG lux = M. bovis BCG, cepa de Montreal, transformada con pSMT1 plásmido lanzadera que lleva los genes luxAB de Vibrio harveyi, bajo el control de la micobacteria GroEL (hsp60) promotor.
UFC = unidades formadoras de colonias (una medida de la viabilidad de micobacterias).

Protocol

1. Preparación de las acciones de BCG reportero lux micobacterias Crecer BCG lux (M. bovis BCG cepa Montreal transformadas con el plásmido lanzadera pSMT1) con agitación a 200 rpm hasta mediados de la fase logarítmica en caldo Middlebrook 7H9 que contenía 0,2% de glicerol, 0,05% entre 80 y 10% de enriquecimiento ADC. Prepare 1 ml de una dilución de 1:10 de la BCG cultura lux en PBS estéril en un tubo luminómetro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) por du…

Discussion

Ensayos bactericidas en el contexto de la investigación vacunas contra la tuberculosis están bien establecidos en modelos animales, donde se aplican a la pantalla de vacunas potencialmente prometedores. La reducción de la carga bacteriana en las funciones de varios órganos como la principal lectura de la inmunogenicidad.

La primera generación de humanos ensayos bactericidas fueron diseñados utilizando los macrófagos solo, infectadas con el M. tuberculosis. UFC sirvió como la…

Materials

Reagent	Company	Cat No
BCG lux	Various	n/a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 broth	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enrichment	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC supplement	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glycerol	Sigma Aldrich	G5150
Hygromycin B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decyl aldehyde	Sigma	D7384-100G
Ethanol (>99.7%)	VWR	101077
Sterile PBS	In House	n/a
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES	Sigma	R0883
Sterile distilled Water	In House	n/a
Equipment
Tube luminometer (injectable port mandatory)	Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless	Corning from VWR	99445-12
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin)	BD	367676
50ml Falcon tubes, conical	BD	352077
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes	VWR	99445-12
Sterilin Universal containers (30 ml)	Laboratory Analysis LTD	128C
Glass beads 2mm diameter	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipettes and pipette boy	any
1000μl and 200μl pipettes and filter tips	any
General laboratory equipment:
Class II safety cabinet cabinet
Refrigerator (4°C)
Centrifuge
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures