S'étendant de courtes séquences d'ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

Résumé

Nous illustrons l'utilisation d'une constante de force axiale pinces optiques pour étudier les propriétés mécaniques des molécules d'ADN courts. En étirant l'ADN axialement, nous minimisons empêchements stériques et des artefacts liés à la manipulation latérale conventionnelle, ce qui nous permet d'étudier les molécules d'ADN plus court ~ 100 nm.

Résumé

Une seule molécule d'ADN techniques d'étirement des longueurs de contour moins d'un kilobases sont marquées par des difficultés expérimentales. Cependant, de nombreux événements intéressants biologiques tels que fixation sur les histones et les protéines médiée par boucle d'ADN ^1,2, se produisent sur ​​cette échelle de longueur. Ces dernières années, les propriétés mécaniques de l'ADN ont été montré à jouer un rôle important dans les processus cellulaires fondamentaux comme l'empaquetage de l'ADN dans les nucléosomes compacts et des fibres de chromatine ^3,4. De toute évidence, il est alors important de comprendre les propriétés mécaniques de courts tronçons de l'ADN. Dans cet article, nous proposons un guide pratique pour une technique simple molécule optique tweezing que nous avons développé pour étudier le comportement mécanique de l'ADN avec des longueurs de contour aussi courts que quelques centaines de paires de bases.

Le principal obstacle à étirer courts segments d'ADN, c'est que les pinces optiques classiques sont généralement conçus pour appliquer une force dans une direction latéral à l'étape ^5,6, (voir Fig. 1). Dans cette géométrie, l'angle entre le bourrelet et la lamelle couvre-objet, dans laquelle l'ADN est attaché, est très raide pour l'ADN de longueur inférieure au micron. La position axiale doivent maintenant être pris en compte, ce qui peut être un défi, et, depuis l'extension entraîne la microsphère près de la lamelle, effets stériques sont améliorées. En outre, en raison de l'asymétrie des microsphères, des extensions latérales génère différents niveaux de couple due à la rotation de la microsphère dans le piège optique depuis la direction de la force de réaction pendant les changements de l'extension.

D'autres méthodes de l'ADN submicronique étirement se heurtent à leurs propres obstacles uniques. Par exemple, un piège à double faisceau optique est limitée à l'étirement d'ADN d'environ une longueur d'onde, au cours de laquelle les effets d'interférence de points entre les deux pièges et de diffusion de la lumière entre les microsphères commence à poser un problème important. Remplacer l'un des piègesavec une micropipette serait très probablement souffrir de problèmes similaires. Si l'on peut utiliser directement le potentiel axiale d'étirer l'ADN, un schéma de rétroaction active serait nécessaire pour appliquer une force constante et la bande passante ce sera très limitée, en particulier à de faibles forces.

Nous contourner ces problèmes fondamentaux en tirant directement l'ADN loin de la lamelle à l'aide d'une force axiale constante de pinces optiques ^7,8. Ce résultat est obtenu en piégeant le bourrelet dans une zone linéaire du potentiel optique, lorsque la force est constante optique-dont la force peut être ajustée par réglage de la puissance du laser. Piégeage à l'intérieur de la région linéaire sert aussi de tout optique de force de serrage sur l'ADN qui s'étend depuis près de 350 nm dans la direction axiale. Nous simultanément compenser la dérive thermique et mécanique par le réglage fin de la position de la platine de telle sorte que d'une microsphère de référence collée sur la lamelle couvre-objet reste à la même position et orientation, unellowing pour une période d'observation pratiquement illimitées.

Protocole

1. Pince à épiler Setup

1. Le faisceau d'un laser à 1064 nm est séparé en deux faisceaux polarisés orthogonalement. On est habitué à manipuler la biomolécule tandis que l'autre est utilisée à des fins d'étalonnage (voir Fig. 2).
2. L'intensité du faisceau est commandée par la manipulation d'un déflecteur acousto-optique (OD), tandis que la position et l'orientation de chaque faisceau est commandé indépendamment par des miroirs d'orientation du faisceau et de télescopes optiques, respectivement.
3. Les faisceaux sont ensuite recombinés avec un autre séparateur de faisceau polarisant et en outre conditionnée par un ensemble final de l'optique téle....

Discussion

Pinces optiques classiques invoquer supporte rétroaction analogique ou commandé par ordinateur pour appliquer une force constante sur un objet réfringent. Ces systèmes de rétroaction actifs ont du mal à effectuer dans des conditions où des changements brusques de l'extension de l'échantillon se produire, par exemple, à partir de la liaison d'une protéine à l'ADN ou l'intensification rapide d'un moteur moléculaire le long d'un filament. Diverses méthodes passives d'application de forces co.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif / équipement	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Laser Nd: YVO4	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optique déflecteur	IntraAction	DTD-274HA6
Objectif Microscope	Olympe	Planapo	60X, NA 1,4
Stade Piezo	Mad Labs Ville	Nano-LP100	Platine XYZ
Caméra CCD	PixeLINK	PL-A741
Photodétecteur	Électro-Optique Technologie	HE-3020
Perles de polystyrène	Spherotech	SVP-08-10	800 nm, la streptavidine recouvert
Anti-digoxigénine	Roche	Du mouton
Amorces	MWG opéron	Oligos personnalisés	Une amorce: la biotine Autres: digoxigénine
Réactifs de PCR	Nouvelle-Angleterre Biolabs	Taq polymérase, dNTP
Lamelle	Fisher Scientific
D'autres produits chimiques pour tampon	Fisher Scientific

11333089001

Documents complémentaires

Coefficient de frottement hydrodynamique A.

Pour la détermination du coefficient de frottement hydrodynamique de la microsphère près de la surface, on peut utiliser les ^5,10 extension suivants:

où le raccourci suivant hcomme cela a été mis en place:

Le coefficient de frottement est définie en termes de la viscosité du fluide η et le rayon de la microsphère, la microsphère avec le centre, situé η une distance au-dessus de la surface. La somme converge assez bien quand il est étendu à une dizaine de termes.

B. Influence de la position axiale sur l'étalonnage Raideur

L'étalonnage de la rigidité piège implique un compromis entre la précision de l'étalonnage, ce qui augmente avec la distance à partir de la surface, et la position axiale réelle lorsque le piège est utilisé expérimentalement. En général, le piège est calibré à environ 800-1000 nm de la surface, qui est supérieure à l'état réel expérimentale.

C. Mise à jour Worm-Like Chain (WLC) Modèle

Les courbes de vulgarisation de force peut être adapté à une modification WLC modèle qui tient compte des effets d'exclusion de volume à la force optique zéro comme suit:

où F est la force _opt optique, x _o est un paramètre propre à l'extension de la force de zéro, x _opt est l'extension sous effort, l est la longueur du contour de l'ADN, et l * _p est un paramètre de forme pour une seconde efficace " longueur de persistance ". _wlc F est donnée par le modèle habituel WLC ¹¹

où ε est l'extension de l'ADN par rapport.