הכנת אינטקט דיסקים זנב שור חולייתי לתרבות איברים
Summary
פרוטוקול זה מדגים טכניקה קצירת עבור coccygeal דיסקים חולייתי שור לתרבות עבור איבר<em> במבחנה</em> איבר תרבות.
Abstract
הדיסק הבין חולייתי (IVD) הוא המפרק המחבר את עמוד השדרה מחוליה לחוליה. זה תפקידי להעביר טעינה של עמוד השדרה ולתת גמישות עמוד השדרה. הוא מלחין של שלושה מדורים: pulposus הגרעין הפנימי ביותר (NP) המקיף ידי fibrosus annulus (AF), ושני endplates סחוס המחבר בין NP ו – AF לגוף השדרה משני הצדדים. הכאב נגרם ככל הנראה על ידי Discogenic מחלה ניוונית הדיסק הבין חולייתי (DDD) ו herniations הדיסק זוהה כבעיה מרכזית בחברה המודרנית שלנו. כדי לחקור מנגנונים אפשריים של ניוון IVD, בתרבות חוץ גופית מערכות איברים עם תאים חיים הדיסק הם מאוד מושך. בתרבות במבחנה של שלם IVDs coccygeal שור התקדמה למערכת מודל רלוונטי, המאפשר את לימוד mechano ביולוגית היבטים בסביבה מבוקר היטב פיזיולוגיים מכני. IVDs זנב שור ניתן להשיג בקלות יחסית במספרים גבוהים יותרד דומים מאוד IVDs המותני האדם ביחס צפיפות התאים, אוכלוסיית התאים ממדים. עם זאת, טכניקות קודמות שור הזנב קצירת IVD שמירה endplates סחוסי ו endplates גרמי נכשל לאחר 1-2 ימים של התרבות מאז המסלולים תזונה נחסמו על ידי ברור דם קרוש. IVDs הם האיברים avascular הגדול ביותר, ולכן, את החומרים המזינים את התאים NP תלויים אך ורק על דיפוזיה דרך בלוטות נימי מהגוף השדרה הסמוכה. נוכחות של פסולת עצם ודם קרוש על פני השטח endplate יכול לעכב דיפוזיה מזין למרכז הדיסק תא הכדאיות פשרה. הקבוצה שלנו הוקמה פרוטוקול מהיר יחסית "סדק", את IVDs מזנב עם סיכון נמוך לזיהום. אנו מסוגלים permeabilize טרי לחתוך משטחים endplate גרמי באמצעות סילון כירורגית שטיפה המערכת, אשר מסיר את קרישי דם ופסולת חיתוך ביעילות רבה מחדש את מסלול דיפוזיה תזונהלמרכז IVD. הנוכחות של צלחות גידול משני צידי העצם בחוליות יש להימנע להסירו לפני התרבות. בסרטון זה, אנו המתאר את הפעולות מכריע במהלך הכנת ולהפגין המפתח תרבות איבר מוצלח שמירה כדאיות התא גבוהה במשך 14 ימים תחת תרבות נפיחות חינם. השעה התרבות יכול להיות ארוך כאשר הסביבה מכני מתאים יכול להישמר באמצעות bioreactor טעינה מכני. הטכניקה הפגינו כאן ניתן להרחיב בעלי חיים אחרים כגון חזירי, ovine ו leporine בידוד IVD הזנב ואת המותני.
Protocol
Discussion
הצעד הראשון לתרבות איברים מוצלחת היא לוודא כי explant לא צריך להיות מזוהמים. הזנב צריך להיות עור לפני שאתם מתחילים עם ההליך. כל שערה חיה הביא למעבדה סטרילית יכול להיות בעייתי מבחינת זיהום. זנב שור אידיאלי צריך להיות טרי ככל האפשר (זה משפיע על כדאיות התא הראשוני). יתר על כן,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי הלאומית השוויצרית למדע (SNF # 310030-127586/1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
