Измерение Быстрые потоки кальция в кардиомиоциты

Summary

Мы представляем метод, чтобы изолировать быстрого (микросекунды) события кальция из медленных потоков в живых клетках помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Метод измеряет интенсивность флуоресценции колебания кальция показатели по записи линии сканирования нескольких сотен пикселей в камере. Гистограмма анализ позволяет выделить временные масштабы различных потоки кальция.

Abstract

Кардиомиоциты имеют несколько Са ^{2 +} потоков различной продолжительности, которые работают вместе для оптимизации функции ^1,2. Изменения в Ca ^{2 +} активности в ответ на внеклеточные агенты, в основном, регулируются фосфолипазы Cβ-Gα _д пути локализован на плазменные мембраны, которая стимулируется агентов, таких как ацетилхолин ^3,4. Недавно мы обнаружили, что плазменные мембраны белковых доменов называют кавеол ^5,6 может завлечь активированный Gα _д ^7. Этот захват имеет эффект стабилизации активированного состояния Gα _д и в результате длительного Са ^{2 +} сигналов в кардиомиоциты и другие типы клеток ^8. Мы обнаружили этот неожиданный результат с помощью измерения динамических характеристик кальция на быстрый масштаба в живых кардиомиоцитов. Короче говоря, клетки загружаются с люминесцентными Са ^{2 +} индикатор. В наших исследованиях мы использовали Са ^{2 +} Зеленый (Invitrogen, Вc.), который экспонатов увеличение интенсивности флуоресценции выбросов при связывании ионов кальция. Интенсивность флуоресценции затем записал для использования линейного сканирования режиме лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет быстро приобретение временного хода интенсивности флуоресценции в пикселях вдоль выбранной линии, производя несколько сотен раз следы на микросекунды масштабе времени. Эти следы очень быстро передаются в Excel, а затем в SigmaPlot для анализа, и по сравнению с следы, полученные для электронного шума, свободного красителя, а также другие элементы управления. Чтобы вскрыть Са ^{2 +} ответы разной скоростью потока, мы провели анализ, который гистограммы binned интенсивности пикселов со временем. Биннинг позволяет группе более 500 следов сканирования и визуализации обобщило результаты во времени и пространстве на одном участке. Таким образом, медленные Са ^{2 +} волны, которые трудно различить, когда сканирует перекрыты из-за различных пик размещения и шума, можно легко увидеть вbinned гистограмм. Очень быстрые потоки в масштабе времени измерения показывают, узкое распределение интенсивности в очень короткое время бункеров в то время как больше Са ^{2 +} волнам шоу binned данных с широким распределением в течение длительного времени бункеров. Эти различные распределения времени позволяют нам анализировать сроки Са ^{2 +} потоков в клетках, и определить их влияние на различные клеточные события.

Protocol

1. Загрузка клетки с кальцием показатели Пластина клеток в 35 со стеклянным дном блюда Маттек (или любой другой стеклянным дном просмотра камеры). При использовании первичных пальто миоцитов камер 1 день до этого с 10μg/ml ламинин. Пластина кардиомиоцитов (изолированных от взрос?…

Discussion

Мы разработали метод для просмотра и быстрой изоляции сигналов кальция в живых кардиомиоцитов. Хотя экспериментальные условия этих измерений были ранее применены к другим системам ячейки ^10, а также кардиомиоцитов ^11, использование гистограмм и бен анализа позволяет исполь…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234