Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Summary

Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Abstract

Kardiyomiyositlerde fonksiyonu ^1,2 optimize etmek için birlikte çalışma süresi değişen birden fazla Ca ² + akıları var . Değişiklikler Ca ^{2 +} ekstrasellüler ajanlar yanıt olarak faaliyet ağırlıklı olarak, ^asetilkolin 3,4 gibi ajanlar tarafından uyarılan plazma membran lokalize fosfolipaz Cβ _Gα q yolağı tarafından düzenlenir . Biz son zamanlarda caveolae ^5,6 olarak adlandırılan plazma membran proteini etki alanı _{Gα ^q} 7 aktif tuzağa olduğunu bulduk . Bu tuzak Gα _q aktive devlet istikrar ve uzun süreli Ca ^{2 +} kardiyomiyositlerde ve diğer hücre tipleri ⁸ sinyalleri sonuçlanan bir etkiye sahiptir. Biz yaşam kardiyomiyositlerde hızlı bir ölçekte dinamik kalsiyum tepkileri ölçerek bu şaşırtıcı bir sonuç ortaya çıkardı. Kısaca, hücreler bir floresan Ca ^{2 +} gösterge ile yüklenir. Çalışmalarda, Ca ^{2 +} Yeşil (Invitrogen,kalsiyum iyonlarının bağlanması üzerine floresans emisyon yoğunluğunda bir artış sergileyen c.). Floresan konfokal mikroskop bir lazer tarama bir satır tarama modunu kullanmak için kaydedilir. Bu yöntem, seçilen bir hat boyunca piksel floresan yoğunluğu zaman elbette hızlı veri toplama mikrosaniye zaman ölçeği üzerinde zaman izleri yüzlerce üreten sağlar. Bu çok hızlı izleri excel ve sonra analiz için Sigmaplot içine transfer edilir ve elektronik gürültü, boya, ve diğer kontroller için elde edilen izleri ile karşılaştırıldığında. Ca ² incelemek için farklı akı oranları ⁺ tepkiler, zamanla piksel yoğunlukları binned histogram analizi yapıldı. Binning tarama 500 izlerini üzerinden grup ve tek bir arsa üzerinde mekansal ve zamansal olarak derlenmiş sonuçları görselleştirmek için bize izin verir. Böylece, tarar, farklı pik yerleştirme ve gürültü nedeniyle, üst üste zaman ayırt etmek zor yavaş Ca ^{2 +} dalgalarının kolayca görülmektedir.binned histogramlar. Çok hızlı ölçüm zaman ölçeği tozlar, uzun ^Ca 2 ise çok kısa bir süre kutularına yoğunluğu dar bir dağılım ^gösterir + dalgaları uzun süre kutuları üzerinde geniş bir dağıtım binned verileri göstermektedir . Bu farklı zaman dağılımları, ^{Ca 2} + akıları zamanlaması bize hücreleri incelemek ve çeşitli hücresel olayları üzerindeki etkilerini belirlemek için izin verir .

Protocol

1. Kalsiyum göstergeleri ile yükleme hücrelerle 35mm cam alt Mattek yemekleri Levha hücreleri (veya başka bir cam alt odaları inceleyen). Kullanarak birincil miyositler kat odaları 1 gün önce 10μg/ml laminin. KB tampon Levha (K-ters Tyrode tampon kardiyak miyositler (yetişkin köpekler, yenidoğan sıçan ya da diğer bir organizmayı izole) 35 Hepes mmol / L, 140 mmol / L KCl, 8 KHCO 3, 2 mmol / mmol / L MgCl 2 L ve 0.4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7…

Discussion

Biz yaşam kardiyomiyositlerde hızlı kalsiyum sinyalleri görüntüleyebilir ve izole etmek için bir yöntem geliştirdik. Bu ölçümlerin deneysel koşullar altında, daha önce diğer hücre sistemleri ¹⁰ gibi kardiyomiyositlerde ¹¹ uygulanmış olsa da, histogramlar ve bin analiz birçok Ca ^{2 +} olayları elde edilecek veri sağlar. Daha hızlı olaylar yavaş olanlar ve bunların altında yatan mekanizmaları anlamak için uyarlanmış modelleri kolayca izole edilebilir. Kültürl…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234