Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Summary

Wir präsentieren eine Methode zur schnellen (Mikrosekunde) Calcium Ereignisse aus langsamer Flüsse in lebenden Zellen mittels Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie zu isolieren. Das Verfahren misst Fluoreszenzintensität Schwankungen des Kalzium-Indikatoren, die von der Aufnahme Line-Scans von mehreren hundert Pixel in einer Zelle. Histogramm-Analyse ermöglicht es uns, die Zeitskalen der verschiedenen Kalzium-Ströme zu isolieren.

Abstract

Kardiomyozyten mehrere Ca ^{2 +} Ströme von unterschiedlicher Dauer, die zusammenarbeiten, um Funktion ^1,2 zu optimieren. Änderungen in Ca ^{2 +-Aktivität} in Reaktion auf extrazelluläre Substanzen wird überwiegend durch die Phospholipase Cb-Gα _q Weg auf der Plasmamembran, die durch Mittel wie Acetylcholin stimuliert ^3,4 lokalisiert ist geregelt. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass Plasmamembran Proteindomänen genannt Caveolae ^5,6 Gα _q ⁷ aktiviert einzufangen. Dieser Einschluss hat den Effekt der Stabilisierung des aktivierten Zustand des Gα _q und was zu einer verlängerten Ca ^{2 +-Signale} in Kardiomyozyten und anderen Zelltypen ^8. Wir deckten dieses überraschende Ergebnis durch die Messung dynamischer Kalzium Antworten auf eine schnelle Skalierung in lebenden Herzmuskelzellen. Kurz gesagt, werden die Zellen mit einem fluoreszierenden Ca ^{2 +-Indikator} geladen. In unseren Studien haben wir Ca ^{2 +} Green (Invitrogen, Inc.), die eine Zunahme der Fluoreszenzemission Intensität der Bindung von Kalzium-Ionen aufweist. Die Intensität der Fluoreszenz wird dann für ein Line-Scan-Modus eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop aufgenommen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Erfassung des zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenz-Intensität in Pixel entlang einer ausgewählten Linie, produziert mehrere hundert Mal Spuren auf die Mikrosekunde Zeitskala. Diese sehr schnell Spuren in Excel und dann in Sigmaplot zur Analyse übertragen werden, und sind die Spuren für die elektronische Rauschen, freien Farbstoff und andere Bedienelemente, verglichen. Um sezieren Ca ^{2 +} Antworten von verschiedenen Flussraten führten wir eine Histogramm-Analyse, dass Pixelintensitäten mit der Zeit klassierte. Binning ermöglicht es uns, Gruppe über 500 Spuren überprüft und visualisieren die erarbeiteten Ergebnisse räumlich und zeitlich in einer einzigen Kurve. So kann die langsame Ca ^{2 +} Wellen, die schwer zu erkennen sind, wenn die Scans überlagert werden durch unterschiedliche Peak Platzierung und Lärm, ohne darin zu sehen,die klassierten Histogramme. Sehr schnelle Flüsse in der Zeitskala der Messung zeigen eine enge Verteilung der Intensitäten in der sehr kurzen Zeitintervallen während mehr Ca ^{2 +} Wellen zeigen klassierten Daten mit einer breiten Verteilung über längere Zeit zu lagern. Diese unterschiedlichen Zeit-Distributionen ermöglichen es uns, das Timing der Ca ^{2 +} Ströme in den Zellen zu zerlegen und deren Auswirkungen auf die verschiedenen zellulären Geschehen bestimmen.

Protocol

1. Loading-Zellen mit Calcium-Indikatoren Platte Zellen in 35mm Glasboden MatTek Gerichte (oder irgendeine andere Glasboden betrachten Kammern). Bei der Verwendung von primären Myozyten Mantel der Kammern 1 Tag vor mit 10μg/ml Laminin. Platte Herzmuskelzellen (isoliert aus erwachsenen Hunden neugeborenen Ratten oder anderen Organismus) in KB-Puffer (K-Umkehr Tyrode Puffer 35 mmol / l HEPES, 140 mmol / l KCl, 8 mmol / l KHCO 3, 2 mmol / L MgCl 2 und 0,4 mmol / l KH 2</sub…

Discussion

Wir haben eine Methode zum Anzeigen und isolieren schnellen Calcium-Signale in lebenden Herzmuskelzellen entwickelt. Während die experimentellen Bedingungen dieser Messungen zuvor auf andere Zellsysteme ¹⁰ sowie Kardiomyozyten ¹¹ angewendet wurde, erlaubt die Verwendung von Histogrammen und bin Analyse von Daten aus vielen Ca ^{2 +} Veranstaltungen erworben werden. Schneller Ereignisse können leicht aus langsameren und Modelle angepasst, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen,…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234