संशोधित खमीर दो हाइब्रिड ग्रोथ फैक्टर progranulin के साथ बातचीत प्रोटीन की पहचान प्रणाली
Summary
हम पारंपरिक खमीर दो संकर स्क्रीनिंग, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने में एक प्रभावी उपकरण आनुवंशिक संशोधित किया है. इस संशोधन स्पष्ट रूप से प्रक्रिया shortens, काम का बोझ कम कर देता है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, झूठी सकारात्मक की संख्या को कम कर देता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है.
Abstract
(PGRN) progranulin भी granulin epithelin अग्रदूत (GEP) के रूप में जाना जाता है, एक 593 अमीनो एसिड autocrine वृद्धि कारक है. PGRN जल्दी embryogenesis, घाव 1 उपचार, सूजन 2, 3, और 4 रक्षा मेजबान सहित शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं की एक किस्म में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा जाना जाता है. PGRN neurotrophic 5 कारक है, और PGRN PGRN प्रोटीन कारण frontotemporal 6 मनोभ्रंश, 7 का आंशिक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप जीन में उत्परिवर्तन के रूप में भी कार्य करता है. हमारे हाल ही के अध्ययन उपास्थि विकास और 8-11 गिरावट का एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में PGRN के अलगाव के लिए नेतृत्व किया है. हालांकि PGRN, लगभग दो दशक पहले की खोज की, कई शारीरिक और रोग की स्थिति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, PGRN की कार्रवाई का फायदा उठाने के लिए और शामिल तंत्र को समझने के प्रयासों को काफी हमारी असमर्थता के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है करने के लिए अपने बाध्यकारी रिसेप्टर (ओं) की पहचान है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम एक मोदी विकसितfied खमीर दो संकर (MY2H) सबसे अधिक इस्तेमाल किया GAL4 2 संकर आधारित प्रणाली पर आधारित दृष्टिकोण. पारंपरिक खमीर दो संकर स्क्रीन के साथ तुलना में, MY2H नाटकीय रूप से स्क्रीन प्रक्रिया shortens और झूठी सकारात्मक क्लोन की संख्या कम कर देता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है, और हम सफलतापूर्वक विभिन्न फँसाना चाहे का बंधनकारी प्रोटीन आयन चैनल 12, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन 10, 13, और वृद्धि कारक 14 सहित, को अलग करने में इस प्रणाली कार्यरत है. इस पत्र में, हम विस्तार में एक उदाहरण है कि पहली ज्ञात PGRN जुड़े 14 रिसेप्टर, 15 के रूप में TNFR2 की पहचान करने के लिए नेतृत्व के रूप में PGRN उपयोग इस MY2H प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन.
Protocol
Discussion
दो संकर खमीर स्क्रीनिंग के लिए प्रोटीन बातचीत 16, 17 की पहचान करने में एक प्रभावी उपकरण साबित हो गया है . , प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए अन्य जैव रासायनिक सह शुद्धि और प्रोटीन चिप्स, दो स?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम NIH अनुसंधान K01AR053210 अनुदान, R01AR061484 और राष्ट्रीय Psoriasis फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
| YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
| YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
| Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
| -Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
- He, Z. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Kessenbrock, K. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatory progranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
- Zhu, J. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
- Yin, F. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
- Van Damme, P. Progranulin functions as a neurotrophic factor to regulate neurite outgrowth and enhance neuronal survival. J. Cell. Biol. 181, 37-41 (2008).
- Baker, M. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
- Cruts, M. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
- Guo, F. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
- Feng, J. Q. Granulin epithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB. J. 24, 1879-1892 (2010).
- Xu, K. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
- Liu, C. J. The role of ADAMTS-7 and ADAMTS-12 in the pathogenesis of arthritis. Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 5, 38-45 (2009).
- Liu, C., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Waxman, S.G. Fibroblast growth factor homologous factor 1B binds to the C terminus of the tetrodotoxin-resistant sodium channel rNav1.9a (NaN). J. Biol. Chem. 276, 18925-18933 (2001).
- Liu, C. J. ADAMTS-7: a metalloproteinase that directly binds to and degrades cartilage oligomeric matrix protein. FASEB. J. 20, 988-990 (2006).
- Tang, W. The Growth Factor Progranulin Binds to TNF Receptors and Is Therapeutic Against Inflammatory Arthritis in Mice. Science. 332, 478-484 (2011).
- Wu, H., Siegel, R. M. Progranulin Resolves Inflammation. Science. 332, 427-428 (2011).
- Hollenberg, S. M. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15, 3813-3822 (1995).
- Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74, 205-214 (1993).
