成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム
Summary
我々は、従来の酵母ツーハイブリッドスクリーニング、タンパク質相互作用の同定に効果的な遺伝的なツールを変更しました。この変更は著しく、プロセスを短縮する作業負荷を軽減、そして最も重要なのは、偽陽性の数を減らします。さらに、このアプローチは、再現性と信頼性です。
Abstract
またgranulin epithelin前駆体（GEP）として知られているProgranulin（PGRN）は、、593アミノ酸のオートクリン増殖因子です。 PGRNは、初期胚発生、創傷治癒1、炎症2、3、および宿主防御4を含む生理と病気のプロセス、さまざまな重要な役割を果たすことが知られている。神経栄養因子5、PGRNタンパク質の原因と前頭側頭型認知症6、7の部分的な損失をもたらすPGRN遺伝子の変異としてPGRNも機能します。私たちの最近の研究では、軟骨の開発と劣化8月11日の重要な調節因子としてPGRNの分離につながっている。 PGRNは、ほぼ二十年前に発見されたものの、、複数の生理学的および病理学的条件にPGRNのアクションを活用し、関与するメカニズムを理解する努力を大幅に結合受容体（複数可）を識別するために、私たちの無力によって妨げられているが決定的な役割を果たしている。この問題に対処するために、我々は修正を開発fied酵母ツーハイブリッド（MY2H）が最も一般的に使用されるGAL4ベースの2 – ハイブリッドシステムに基づくアプローチ。従来の酵母ツーハイブリッドスクリーンと比較して、MY2Hは劇的に画面のプロセスを短縮し、偽陽性クローンの数を減らすことができます。さらに、このアプローチは、再現性と信頼性であり、そして我々が正常にイオンチャネル12、細胞外マトリックスタンパク質10、13、および成長因子14を含む様々なベイトの結合タンパク質を、単離することにこのシステムを採用している。本稿では、最初に知られてPGRN関連受容体14,15としてTNFR2の同定につながった例として、PGRNを用いて詳細にこのMY2H実験手順を説明します。
Protocol
Discussion
酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、タンパク質の相互作用16、17を同定する際に有効なツールであることが証明されている。このような生化学的共精製とプロテインチップなどの蛋白質 – 結合パートナーを同定するための他のアプローチと比較して、酵母ツーハイブリッドシステムは、比較的単純な実験でコード配列の非常に高い数字をスクリーニングに用いることが?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの研究助成K01AR053210、R01AR061484と国立乾癬財団からの助成金によって賄われていた。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
| YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
| YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
| Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
| -Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
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