Modifisert Gjær-Two-Hybrid System for å identifisere proteiner i samspill med Growth Factor Progranulin

Summary

Vi har endret den konvensjonelle gjær to-hybrid screening, et effektivt genetiske verktøy for å identifisere protein interaksjon. Denne endringen forkorter markert prosessen, reduserer arbeidsmengden, og viktigst, reduserer antall falske positiver. I tillegg er denne tilnærmingen reproduserbar og pålitelig.

Abstract

Progranulin (PGRN), også kjent som granulin epithelin forløper (GEP), er en 593-amino-syre autocrine vekstfaktor. PGRN er kjent for å spille en avgjørende rolle i en rekke fysiologiske og sykdom prosesser, herunder tidlig embryogenese, sår ^en helbredelse, betennelse ^{2, 3,} og vert forsvar ^fire. PGRN fungerer også som en neurotrophic faktor ^5, og mutasjoner i PGRN genet resulterer i delvis tap av PGRN protein årsaken frontotemporal demens ^{6, 7.} Våre nyere studier har ført til isolering av PGRN som en viktig regulator av brusk utvikling og degradering ^8-11. Selv PGRN oppdaget nesten to tiår siden, spiller avgjørende roller i flere fysiologiske og patologiske tilstander, innsats for å utnytte handlinger PGRN og forstå de mekanismene som er involvert har vært betydelig hemmet av manglende evne i vår for å identifisere sin binding reseptor (s). For å løse dette problemet, har vi utviklet et MODIsert gjær to-hybrid (MY2H) tilnærming basert på de mest brukte GAL4 basert 2-hybrid system. Sammenlignet med den konvensjonelle gjær to-hybrid skjerm, forkorter MY2H dramatisk skjermen prosessen og reduserer antall falske positive kloner. I tillegg er denne tilnærmingen reproduserbare og pålitelige, og vi har med hell brukt dette systemet i å isolere bindende proteiner av ulike agn, inkludert ion ¹² kanaler, ekstracellulær matrix protein ^{10, 13} og vekstfaktor ^14. I denne artikkelen beskriver vi dette MY2H eksperimentelle prosedyren i detalj ved hjelp PGRN som et eksempel som førte til identifisering av TNFR2 som den første kjente PGRN-forbundet reseptor ^{14, 15.}

Protocol

1. Bakgrunnsinformasjon Gjær to-hybrid systemet er et kraftig genetisk teknikk som brukes til å oppdage protein-protein interaksjoner 16, 17. Flere typer 2-hybrid systemer, slik som Lexa-baserte systemer, Sos Rekruttering System, og bakterier eller pattedyr celle-basert 2-hybrider, er kommersielt tilgjengelig, fokuserer denne artikkelen spesifikt på modifikasjoner av de mest brukte GAL4 basert gjær 2-hybrid system. Kort fortalt er metoden basert på egenskapene til gjær GAL…

Discussion

Gjær to-hybrid screening har vist seg å være et effektivt verktøy i å identifisere protein interaksjoner ^{16, 17.} Sammenlignet med andre tilnærminger for å identifisere protein-binding partnere, som for eksempel biokjemiske co-rensing og protein chips, gjær to-hybrid systemet er en sensitiv genetisk tilnærming som kan brukes til screening svært høyt antall koding sekvenser i en relativt enkle eksperimentet; i Dessuten oppdager det in vivo samhandling og trenger ikke komplisert protein rensing. Selvf…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
ProQuest two-hybrid system	Invitrogen	10835
YPD Growth Medium	Clontech	630409
YPD Agar Medium	Clontech	630410
Minimal SD agar Base	Clontech	630412
-Leu DO Supplement	Clontech	630414
-Leu/-Trp DO Supplement	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement	Clontech	630425
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Luria broth (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Sonicated Salmon Sperm DNA	Stratagene	201190
Ampicillin	AMRESCO	0339
Kanamycin Sulfate	Invitrogen	11815-024
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells	Invitrogen	18265-017
Trizma® base	Sigma-Aldrich	T6066
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	L4158
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	ED
Nitrocellulose Membrane	Bio-Rad	162-0115
10-cm petri dish	ITI Scientific	CT-903
Incubator (30 °C)	ATR (Ecotron)