Измененный Дрожжи-Two-гибридная система для идентификации белков Взаимодействие с фактор роста Progranulin

Summary

Мы модифицировали обычные дрожжи двугибридная скрининга, эффективный генетический средством выявления белковых взаимодействий. Эта модификация значительно сокращает процесс, снижает рабочую нагрузку, и, самое главное, снижает количество ложных срабатываний. Кроме того, этот подход является воспроизводимым и надежно.

Abstract

Progranulin (PGRN), также известный как granulin epithelin предшественника (ПВС), является 593-амино-кислоты аутокринной фактора роста. PGRN как известно, играет важную роль в различных физиологических и болезненных процессов, в том числе раннего эмбриогенеза, заживление ран ^1, воспаления ^{2, 3} и ⁴ иммунной защиты. PGRN также функционирует как нейротрофический фактор ^5, а мутации в гене PGRN приводит к частичной потере причиной PGRN белка лобно-височной деменции ^{6, 7.} Наши недавние исследования привели к изоляции PGRN как важный регулятор хряща развития и деградации ^8-11. Хотя PGRN, обнаружили почти два десятилетия назад, играет решающую роль во многих физиологических и патологических состояний, усилия, направленные на использование действия PGRN и понять механизмы, участвующие были значительно препятствует нашей неспособности определить его связывание рецепторов (ы). Чтобы решить эту проблему, мы разработали модификациюFied дрожжей двух гибридных (MY2H) подход, основанный на наиболее часто используемые GAL4 основан 2-гибридной системы. По сравнению с обычными дрожжами двугибридная экран, MY2H резко сокращает экране процесс и снижает количество ложных положительных клонов. Кроме того, этот подход является воспроизводимым и надежно, и мы успешно используют эту систему в изоляции связывающих белков различных приманок, в том числе ионный канал ^12, внеклеточный белок матрицы ^{10, 13,} и фактор роста ^14. В этой статье мы описываем эту MY2H экспериментальная процедура подробно использованием PGRN в качестве примера, который привел к идентификации TNFR2 как первый известный PGRN связанных рецепторов ^{14, 15.}

Protocol

1. Исходная информация Дрожжей двугибридная система представляет собой мощный генетический метод, используемый для обнаружения белок-белковых взаимодействий 16, 17. Несколько видов 2-гибридных систем, таких как LexA систем, основанных на системе Сос вербовкой, и бактер…

Discussion

Дрожжи двугибридная скрининга оказалась эффективным инструментом в определении взаимодействия белка ^{16, 17.} По сравнению с другими подходами для идентификации белков-связывающих партнеров, таких как биохимические совместной очистки и белковых чипов, дрожжи две гибридные систем?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
ProQuest two-hybrid system	Invitrogen	10835
YPD Growth Medium	Clontech	630409
YPD Agar Medium	Clontech	630410
Minimal SD agar Base	Clontech	630412
-Leu DO Supplement	Clontech	630414
-Leu/-Trp DO Supplement	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement	Clontech	630425
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Luria broth (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Sonicated Salmon Sperm DNA	Stratagene	201190
Ampicillin	AMRESCO	0339
Kanamycin Sulfate	Invitrogen	11815-024
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells	Invitrogen	18265-017
Trizma® base	Sigma-Aldrich	T6066
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	L4158
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	ED
Nitrocellulose Membrane	Bio-Rad	162-0115
10-cm petri dish	ITI Scientific	CT-903
Incubator (30 °C)	ATR (Ecotron)