Vi har ändrat den konventionella jäst två-hybrid screening, ett effektivt genetiska verktyg för att identifiera protein interaktion. Denna ändring förkortar markant processen, minskar arbetsbördan, och viktigast, minskar antalet falska positiva. Dessutom är denna metod reproducerbar och tillförlitlig.
Progranulin (PGRN), även känd som granulin epithelin föregångare (GEP), är ett 593 aminosyror autokrin tillväxtfaktor. PGRN är känd för att spela en avgörande roll i en mängd olika fysiologiska och sjukdom processer, inklusive tidig embryogenes, sårläkning 1, inflammation 2, 3, och värd försvar 4. PGRN fungerar också som en Neurotrophic Factor 5, och mutationer i PGRN genen resulterar i partiell förlust av PGRN proteinet orsakar frontotemporal demens 6, 7. Våra senaste undersökningar har lett till isolering av PGRN som en viktig reglerare av brosk utveckling och nedbrytning 8-11. Även PGRN upptäckte nästan två decennier sedan, spelar avgörande roller i flera fysiologiska och patologiska tillstånd, insatser för att utnyttja åtgärder PGRN och förstå om de berörda mekanismerna ha varit avsevärt försvårats av vår oförmåga att identifiera dess bindande receptor (er). För att lösa detta har vi utvecklat en modified jäst två-hybrid (MY2H) som bygger på de vanligaste GAL4 baserad 2-hybridsystem. Jämfört med konventionell jäst två-hybrid-skärm, förkortar MY2H dramatiskt skärmen processen och minskar antalet falska positiva kloner. Dessutom är denna metod reproducerbara och tillförlitliga, och vi har framgångsrikt används detta system i isolera proteiner av olika beten, bland jonkanal 12, extracellulära matrix protein 10, 13 och tillväxtfaktor 14. I denna skrift beskriver vi här MY2H experimentella förfarandet i detalj med hjälp av PGRN som ett exempel som ledde till identifiering av TNFR2 som den första kända PGRN-associerad receptor 14, 15.
Jäst två-hybrid screening har visat sig vara ett effektivt verktyg för att identifiera proteininteraktioner 16, 17. Jämfört med andra metoder för att identifiera protein-bindande partners, såsom biokemiska co-rening och proteinchip, jäst två-hybrid systemet är en känslig genetisk metod som kan användas för screening mycket stort antal av kodande sekvenser på ett relativt enkelt experiment, i Dessutom registrerar den att det in vivo interaktioner och behöver inte komplicerat protein rening. Natu…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av NIH forskningsanslag K01AR053210, R01AR061484 och ett bidrag från National Psoriasis Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
-Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
-Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |