Biz geleneksel maya iki-hibrit taraması, protein etkileşimleri tanımlayan genetik etkili bir aracı olarak var. Bu değişiklik, sürecin belirgin kısaltır, iş yükünü azaltır ve en önemlisi, yanlış pozitiflerin sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir.
Granulin epithelin habercisi (GEP) olarak da bilinen Progranulin (PGRN), 593 amino asit otokrin büyüme faktörü. PGRN dahil olmak üzere, çok çeşitli fizyolojik ve hastalık süreçleri erken embriyogenez, yara iyileşmesi 1, inflamasyon 2, 3, ve 4 konak savunmasında kritik bir rol oynadığı bilinmektedir. Nörotrofik faktör 5 ve kısmi PGRN protein neden frontotemporal demans 6, 7 kaybı ile sonuçlanan PGRN gen mutasyonları gibi PGRN fonksiyonlar. Son çalışmalar, kıkırdak gelişimi ve bozulması 8-11 için önemli bir düzenleyici olarak PGRN izolasyonu yol açmıştır . PGRN, yaklaşık iki yıl önce keşfetti rağmen, birden fazla fizyolojik ve patolojik koşullar PGRN eylemleri istismar ve ilgili mekanizmaları anlamak için çabalarını önemli ölçüde bağlayıcı reseptör (ler) tespit edilememesi nedeniyle engellense de önemli roller oynamaktadır. Bu sorunu gidermek için modifiye geliştirdiğı maya iki hibrid (MY2H) en sık kullanılan GAL4 tabanlı 2-hibrid sistem tabanlı bir yaklaşım. Konvansiyonel maya iki hibrit ekran ile karşılaştırıldığında, MY2H ekran sürecini önemli ölçüde kısaltan ve yanlış pozitif klonların sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir ve bu sistemin başarıyla iyon kanal 12, ekstrasellüler matriks protein 10, 13, ve 14 büyüme faktörü de dahil olmak üzere çeşitli yemler bağlayıcı proteinlerin izole istihdam. Bu çalışmada, bu MY2H deneysel işlemin bilinen ilk PGRN-ilişkili reseptör 14, 15 olarak TNFR2 tanımlanmasına yol açan bir örnek olarak PGRN kullanarak ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Maya iki hibrit taraması, protein etkileşimleri 16, 17 belirlenmesinde etkili bir araç olduğu kanıtlanmıştır . ; Biyokimyasal ortak arıtma ve protein cips, maya iki hibrid sistemi, nispeten basit bir deney dizileri kodlama çok yüksek sayıda tarama için kullanılan hassas bir genetik yaklaşım olarak protein bağlayıcı ortakları belirlemek için diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında Buna ek olarak, in vivo etkileşim içinde algılar ve karmaşık protein saflaştırılması ge…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH araştırma hibeleri K01AR053210, R01AR061484 ve Ulusal Sedef hastalığı Vakfı hibe tarafından finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
-Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
-Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |