Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi
Summary
Sinovyal sıvıda yüksek düzeyde insan eklem kondrosit kültür 3D sistemi açıklanmıştır. Sinovyal sıvı eklem kıkırdağı için en doğal mikroçevresinin yansıtır ve kolayca elde ve saklanabilir. Bu sistem, böylece kıkırdak rejenerasyon eğitim ve artrit tedavisi için tarama terapötikler için kullanılabilir.
Abstract
Kıkırdak imha osteoartrit merkezi bir patolojik özellik, ABD'nin önde gelen sakatlık nedenidir. Kıkırdak yetişkin in vivo olarak çok verimli bir şekilde yeniden değildir; ve bunun sonucu olarak, osteoartrit, kıkırdak kaybı geri döndürülemez açar ve kronik ağrı ve hareketsizlik 1,2 eşlik ediyor . Kıkırdak doku mühendisliği, doku işlevini yeniden ve geri yüklemek için umut verici bir potansiyel sunmaktadır. Bu teknoloji, genellikle doğal veya sentetik iskeleleri ve kültür içine çıkan 3D 3-6 in vivo bir defekt içine nakledilen bir biyokimyasal ve biyomekanik olgun doku mühendisliği amacı ile bir süre içinde dengeli bir orta inşa ekim kondrosit içerir . Kondrosit büyüme ve matriks birikimi için optimal bir durum ulaşmak kıkırdak doku mühendisliği başarısı için esastır.
Arktik doğal eklem boşluğu, kıkırdakkemik bilirsiniz yüzey sinovyal sıvıdaki yıkanıyor. Bu berrak ve yapışkan sıvı besin sağlar avasküler eklem kıkırdağı ve büyüme faktörleri, sitokinler ve kondrosit metabolizması 7,8 için önemli olan enzimleri içerir. Ayrıca, eklem sıvısı ile kıkırdak yüzeyler arasında esas olarak iki temel bileşen, hyaluronan ve lubricin 9 10 salgılayan düşük sürtünme hareketi kolaylaştırır. Buna karşın, doku mühendislik kıkırdak en sık yapay medyada kültüre. Bu medya muhtemelen kondrosit metabolizması eğitim için daha fazla tanımlanmış koşullar sağlamak mümkün iken, eklem sıvısı, eklem kondrosit içinde bulunduğu doğal çevreye en doğru yansıtan
Gerçekten de, sinoviyal sıvı almak ve saklamak için kolay olma avantajı vardır ve genellikle düzenli olarak vücut tarafından doldurulan olabilir. Çeşitli gruplar büyüyen insan, sığır, tavşan ve köpek c sinovyal sıvı ile kültür ortamı takviyehondrocytes, ancak çoğunlukla sadece sinoviyal sıvı (% 20 altında) 11-25 düşük düzeylerde kullanılır. Tavuk, at ve insan kondrosit sinovyal sıvıda yüksek yüzdesi ile orta kültüre alınmış olsa da, bu kültür sistemleri, iki boyutlu 26-28 edildi. Burada 21 günlük bir süre içinde sinoviyal sıvının yüksek bir yüzdesi (% 100'e kadar) insan eklem kondrosit kültür yöntemi ile 3D sistemi mevcut. Bunu yaparken, biz üstesinden sinovyal sıvıda yüksek viskozite tarafından sunulan önemli bir engel. Bu sistem, 3 boyutlu bir ortamda, daha doğal ortam taklit kıkırdak için doğal ortamı oluşturan diğer iki önemli faktörler (oksijen basıncı ve mekanik yükleme) 29,30 ile kombine edilebilir sinoviyal sıvı insan kondrosit eğitim imkanı sağlar kıkırdak büyüme. Ayrıca, Bu sistem kondrosit sinoviyal sıvı aktivitesi assaying için kullanılır ve geliştirmek için bir platform sağlamak olabilirkıkırdak rejenerasyon teknolojileri ve artrit için tedavi seçenekleri.
Protocol
Discussion
Bu raporda, insan sinovyal sıvıda yüksek konsantrasyonlarda içeren ortamda 3 boyutlu bir ortamda insan eklem kondrosit kültür sağlayan bir yöntem geliştirdi. Sinovyal sıvı eklem boşluğu, eklem kondrosit bulunduğu doğal ortamı oluşturan önemli bileşenlerinden biridir. Ancak, sinovyal sıvıda viskozite kondrosit üç boyutlu, uzun vadeli kültür için önemli bir sorun olmuştur. 3D viskoz bir ortamda inşa etmek ve önlemek için agregasyonu bile besin dağılımı sürdürmenin zorluğu aşmak için…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Robin Nye (Tufts Tıp Merkezi), Tomoya Uchimura ve Dana Cairns (Tufts Üniversitesi), sinoviyal sıvı depolama ve santrifüj ile yardım sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma LZ (1R01AR059106-01A1) NIH tarafından finanse edildi
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
| Primers sequences | |||
| Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
| MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
| MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
| Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
| Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations–United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
- Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. . 121, 107-118 (1976).
