En 3D System for dyrking Menneskelig artikulære chondrocytes i synovialvæsken

Summary

En 3D-system for dyrking menneskelig artikulære chondrocytes i høye nivåer av synovial væske er beskrevet. Leddvæsken reflekterer den mest naturlige mikromiljøet for leddbrusk, og kan lett innhentes og lagres. Dette systemet kan dermed brukes til å studere brusk regenerering og for screening legemiddelselskap for behandling av leddgikt.

Abstract

Brusk ødeleggelse er et sentralt patologisk trekk ved slitasjegikt, en ledende årsak til uførhet i USA. Brusk i den voksne ikke regenerere ikke veldig effektivt in vivo, og som et resultat fører slitasjegikt til irreversible brusk tap og er ledsaget av kroniske smerter og immobilitet ^1,2. Brusk tissue engineering tilbyr lovende potensial til å fornye og gjenopprette vev funksjon. Denne teknologien innebærer vanligvis seeding chondrocytes i naturlige eller syntetiske stillaser og dyrking den resulterende 3D ​​konstruere en balansert medium over en tidsperiode med et mål av engineering en biokjemisk og biomekanisk modne vev som kan transplanteres inn i en defekt område in vivo ^3-6 . Oppnå en optimal forutsetning for chondrocyttransplantasjon vekst og matrise deponering er avgjørende for å lykkes med brusk tissue engineering.

I de innfødte felles cavity, brusk på arktiskeular overflaten av benet er badet i synovialvæsken. Dette klar og tyktflytende væske gir næringsstoffer til avascular leddbrusk og inneholder vekstfaktorer, cytokiner og enzymer som er viktige for chondrocyttransplantasjon metabolisme ^7,8. Videre letter synovialvæsken lav friksjon bevegelse mellom cartilaginous flater hovedsakelig gjennom sekresjon to viktige komponenter, hyaluronan og lubricin ^{9 10.} I kontrast er vevet utviklet brusk oftest dyrket i kunstige medier. Mens disse mediene er trolig i stand til å gi mer definerte vilkår for å studere chondrocyttransplantasjon stoffskifte, synovialvæsken mest presist reflekterer naturen som artikulære chondrocytes bor i.

Har faktisk leddvæsken fordelen av å være lett å få tak og lagre, og kan ofte fornyes jevnlig av kroppen. Flere grupper har supplert den kulturen medium med synovialvæsken i voksende menneske, storfe, kanin og hund chondrocytes, men for det meste brukes kun lave nivåer av leddvæske (under 20%) ^11-25. Mens kylling, hest og menneske chondrocytes har vært dyrket i medium med høyere prosentandel av synovialvæsken, ble disse kultur systemene todimensjonal ^26-28. Her presenterer vi vår metode for dyrking menneskelig artikulære chondrocytes i et 3D-system med en høy andel av leddvæske (opp til 100%) over en periode på 21 dager. Ved å gjøre det, overvant vi et stort hinder presentert av den høye viskositeten på synovialvæsken. Dette systemet gir mulighet for å studere menneskelig chondrocytes i synovialvæsken i et 3D miljø, som kan videre kombineres med to andre viktige faktorer (oksygen spenninger og mekanisk belastning) ^29,30 som utgjør det naturlige miljø for brusk å etterligne de naturlige miljø for brusk vekst. Videre kan dette systemet også brukes for å analysere synovialvæsken aktivitet på chondrocytes og gi en plattform for utviklingbrusk regenerering teknologier og behandlingsalternativer for leddgikt.

Protocol

En 3D-system for dyrking human artikulære chondrocytes i synovialvæsken I dette arbeidet, innkapslet vi menneskelige artikulære chondrocytes i alginat perler ved hjelp av en modifisert produksjon-foreslo innkapsling protokoll (Lonza, og 31). Ved hjelp av disse 3D-konstruksjoner, har vi utviklet et system for dyrking celler i en kultur medium som inneholder varierte prosenter av menneskelig synovialvæsken og har vurdert disse 3D konstruksjoner for brusk genuttrykk. <p class…

Discussion

I denne rapporten har vi utviklet en metode som gjør det mulig for kulturen av menneskelig artikulære chondrocytes i et 3D miljø i medium som inneholder høye konsentrasjoner av menneskelig leddvæske. Synovialvæsken er en av de viktigste komponentene som utgjør det naturlige miljøet i det felles hulrom, hvor artikulær chondrocytes bor. Imidlertid har viskositet synovialvæsken vært en stor utfordring for tredimensjonale langsiktig dyrking av chondrocytes. For å overvinne utfordringen med å opprettholde selv n…

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Alginate (Alginic Acid sodium salt)	Sigma	A2158-250G	2.4% solution stored at 40°C
Calcium Chloride Dihydrate, Granular	J.T. Baker	A19339
Chondrogenic Growth media	Lonza	CC-3156 (base media)
		CC-4409 (supplement)
Chondrogenic Differentiation Media	Lonza	CC-3226 (base media)
		CC-4408 (supplement)
Human articular chondrocytes	Lonza	CC-2550
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
RNeasy mini kit (for RNA extraction)	Qiagen	74104
PCR reagents: SYBR-green	Quanta	95053-500
12 ml syringe	Tyco-Kendall-Monoject	512852
22-Gague Hypodermic Needle	Tyco-Kendall-Monoject	8881
Microscope	Olympus	IX71
Platform rocker	Thermoscientific thermolyne	Vari-mix
Primers sequences
Collagen IIa-forward	5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′
Collagen IIa-reverse	5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′
MMP13-forward	5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′
MMP13-reverse	5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′
Caspase 3-forward	5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′
Caspase 3-reverse	5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′