تشريح العقدة والثقافة والفرخ Statoacoustic Explants النخاع الشوكي في الهلام الكولاجين لفحوصات ثمرة Neurite
Summary
نحن لشرح كيفية تشريح والثقافة الفرخ E4 العقدة statoacoustic E6 explants والحبل الشوكي. تستزرع Explants المصل تحت ظروف الأجواء الخالية من المواد الهلامية في الكولاجين 3D لمدة 24 ساعة. يتم اختبار Neurite الاستجابة مع النمو المتوسط عامل وتستكمل مع بروتين المغلفة الخرز.
Abstract
ومعصب الأجهزة الحسية في الأذن الداخلية الدجاج من العمليات المحيطية من العقدة statoacoustic (SAG) الخلايا العصبية. تعصيب الجهاز الحسي يعتمد على مزيج من العظة التوجيه محوار 1 و 2 بقاء العوامل تقع على طول مسار المحاوير المتزايد و / أو ضمن أهدافها الجهاز الحسي. على سبيل المثال ، ولدت مع وظيفية تدخل طريقا محوار توجيه الإشارات الكلاسيكية ، semaphorin – neuropilin ، misrouting من المحاور أذني 3. أيضا ، أعرب العديد من عوامل النمو في الأهداف الحسية في الأذن الداخلية ، بما في ذلك Neurotrophin – 3 (NT – 3) وعامل التغذية العصبية الدماغي المشتقة (BDNF) ، وقد تم التلاعب في الحيوانات المعدلة وراثيا ، مما أدى مرة أخرى إلى misrouting من المحاور SAG 4. هذه الجزيئات نفسه يعزز بقاء ونمو الخلايا العصبية neurite SAG الفرخ 5،6 في المختبر.
هنا ، نحن وصف وشرح الطريقة في المختبر ونحن حاليا شالغناء لاختبار مدى استجابة neurites SAG فرخ لبروتينات قابلة للذوبان ، بما في ذلك morphogens المعروفة مثل Wnts ، فضلا عن عوامل النمو التي تعتبر مهمة لتعزيز SAG ثمرة neurite وبقاء الخلايا العصبية. باستخدام هذا النظام النموذجي ، ونأمل في استخلاص استنتاجات بشأن الآثار التي يمكن أن يفرز يغاندس تمارس على بقاء الخلايا العصبية وثمرة neurite SAG.
يتم تشريح explants SAG يوم الجنينية 4 (E4) والمثقف في المواد الهلامية الكولاجين ثلاثي الأبعاد تحت ظروف خالية من المصل لمدة 24 ساعة. أولا ، يتم اختبار الاستجابة من جانب neurite explants زراعة المتوسطة البروتين تستكمل. ثم لنتساءل عما إذا كانت مصادر نقطة يغاندس يمكن أن يفرز تأثيرات على الاتجاه ثمرة neurite ، وشارك في explants مثقف مع بروتين المغلفة الخرز ويعاير لقدرة حبة لتعزيز محليا أو تحول دون ثمرة. نحن تشمل أيضا مظاهرة للتشريح (تعديل بروتوكول 7) وثقافة E6 explants الحبل الشوكي. نحنتستخدم بشكل روتيني explants النخاع الشوكي للتأكد من النشاط الحيوي للبروتينات والخرز البروتين غارقة ، والتحقق من الأنواع عبر التفاعل مع أنسجة الفرخ ، في ظل الظروف نفس ثقافة explants SAG. هذه المقايسات في المختبر لفحص مريحة بسرعة عن الجزيئات التي تمارس التغذية (بقاء) أو مدار (الاتجاه) التأثيرات على الخلايا العصبية SAG ، وخصوصا قبل تنفيذ الدراسات في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك ، وهذه الطريقة تسمح للاختبار الجزيئات الفردية بموجب المصل خالية من الشروط ، مع بقاء الخلايا العصبية ارتفاع 8.
Protocol
Discussion
نقدم طريقة لتشريح والثقافة وE4 SAG E6 explants الحبل الشوكي ، من الحمص ، في ظل ظروف الأجواء الخالية من المصل. ويجري حاليا استخدام هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الآثار المترتبة على مختلف يغاندس يفرز على بقاء الخلايا العصبية وثمرة neurite SAG. الرواية جوانب من هذا البروتوكول بما في…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1DC002756 المنح ومؤسسة البحوث بوردو. نشكر دوريس وو وتشانغ فيسه للحصول على المشورة مع التجارب ورودني ماكفيل للمساعدة في الأرقام.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
|
||
| Dissection microscope |
|
We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
|
||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
|
||
|
|||
| Dissection Materials |
|
||
| Sylgard© coated petri dish |
|
||
| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
|
|||
| E4 and E6 chicken eggs |
|
||
| Chick Ringer’s solution |
|
Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
|
|||
| Collagen preparation |
|
||
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
|
|||
| Explant culture |
|
||
| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
|
|||
| Immunohistochemistry |
|
||
| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
|
Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
References
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
