条件付きで大人のゼブラフィッシュの網膜での標的タンパク質の発現をノックダウンする方法は、硝子体内アンチセンスモルフォを注入して網膜にそれらをelectroporating含まれ、説明されています。得られたタンパク質を再生成または無傷の網膜におけるタンパク質の役割をテストできるようになる、数日間ノックダウンされている。
人間は網膜神経細胞を死にや病気の再生成することができないため、多くの壊滅的な継承された眼疾患は進行性かつ不可逆的失明につながる。対照的に、成人のゼブラフィッシュの網膜は、自発的に網膜穿刺、化学的ア ブレーション、集中高温、そして強烈な光治療1から8を含む様々な網膜損傷モデルの様々な、で失われている任意のニューロンのクラスを再生成するための堅牢な機能を有している。私たちの研究室では、広範囲に硝子体内ウアバイン注射2、5、9の後に一定の強い光の治療と内側の網膜神経細胞に続く光受容体の再生を特徴とする。すべてのケースでは、居住者ミュラーグリアの増殖とそれらが欠損ニューロンへの分化を適切網膜層、に移行し続ける神経前駆細胞を、生成するために細胞周期を再入力してください。
我々は、光玉の再生中に5さまざまな段階を特徴付け特定の細胞応答によって強調されたGED網膜。我々は、mRNAのマイクロアレイ解析10で網膜再生の各段階でいくつかの発現の異なる遺伝子を同定した。これらの遺伝子の多くは、眼の発達に重要である。網膜再生中に各候補遺伝子/タンパク質の役割をテストするために、我々は条件付きで大人の網膜の再生時にのみ回で候補タンパク質の発現を制限する方法を開発する必要がありました。
モルホリノオリゴは広くヒトの異種移植片11-14のマウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、 アフリカツメガエルの開発中に特定のタンパク質の機能の喪失を研究するために使用され、腫瘍されています。これらは、いずれかのターゲットRNAのスプライシングや翻訳をブロックするように相補的なRNA配列とオリゴの塩基対を修正。モルフォは、細胞中で安定であり、排除または3〜5日12"ノックダウン"タンパク質発現することができます。
ここで、我々は、成人のゼブラフィッシュの網膜で効率的にノックダウンの標的タンパク質の発現に方法を説明します。このメソッドは、大人のゼブラフィッシュの眼の硝子体に注入されるlissamineタグ付きアンチセンスモルフォを採用しています。電極鉗子を使用して、モルフォリノは、背側と中央の網膜のすべての細胞型にエレクトロれる。 Lissamineは、エレクトロポレーション用モルホリノ上の電荷を提供し、網膜細胞におけるモルホリノの存在を評価するために可視化することができます。
網膜での条件付きノックダウンは、再生中に別々のタイミングで特定のタンパク質の役割を調べるために使用することができます。さらに、このアプローチは視覚伝達と二次ニューロンにおける視覚処理などのプロセスで、損傷のない網膜内の特定のタンパク質の役割を研究するために使用することができます。
最近、2つのマイクロアレイ解析は、光損傷を受けた網膜または外科的に摘出した網膜のパッチ10、16のいずれかの再生中に発生した遺伝子発現の変化を調べた。両方の研究では、どちらかの可能性などの細胞周期にミュラーグリアの再突入のような網膜再生中に発生したさまざまなイベント、ために必要とされる、増減、式の中で重大な変化を示した多数の遺伝子を明らかにしたの増殖と移動を続け、損傷した網膜層、および正しい神経細胞のタイプに神経前駆細胞の分化に神経前駆細胞。これら二つのマイクロアレイデータセットの直接比較は、これらの細胞イベントに関与する可能性がある候補遺伝子を明らかにしながら、最終的にこれらの遺伝子とその符号化されたタンパク質は、それらが神経再生のために必要かどうかを判断するためにテストする必要があります。ここで、我々はconditioに強力な機能喪失型のアプローチを説明します大人のゼブラフィッシュの網膜への関心のナリーノックダウンタンパク質。この手法は、DNA複製17から19に必要な細胞外および細胞内蛋白質だけでなく、シグナル伝達分子、転写因子とタンパク質の両方を研究するために使用されています。従って、この方法は非常にゼブラフィッシュで大人の網膜再生の根底にある分子メカニズムの理解を支援しています。
成功したプロトコルが達成される前に、我々は、複数のエレクトロポレーションパラメータ(電圧、パルス数、パルス間の時間)テスト。回生ゼブラフィッシュ尾鰭の鰭にelectroporatingモルフォの前回の報告書は、低電圧(15 V)20時10パルスを使用。大人のゼブラフィッシュの網膜は、複数の細胞層に囲まれ、ピンセット電極に容易にアクセスできないされているため、フィンで使用するパラメータは、効率的に大人の網膜にモルフォのelectroporatingで不成功だった。逆に、高電圧(100 V)、しばしば解像度魚の死にulted。最近、80 Vの5パルスは、新生仔マウス子犬網膜21にプラスミドDNAをエレクトロに記述されていた。我々は75のやや強い2パルスは、Vが治療を受けた魚の100%の生存率を持つ成人のゼブラフィッシュの網膜にモルフォの成功したエレクトロポレーションにあることが判明。さらに、我々は、角膜のコンポーネント(または外部最も)最も外側の除去は非常にエレクトロポレーションの効率を増加させることを発見した。パルスの数を増やすと、この組織の除去が不要なこともありますでなく、より大きな組織の損傷を引き起こす可能性があります。大規模な対照研究は、これらのパラメータは、任意の重要な網膜細胞死を引き起こしたり、光受容体再生19中に観察された特定の細胞応答を変化させなかったことが示された。機能獲得型研究は、 生体内でこのテクニックを使用して、現在一貫してすべてのRに大きなリボ核酸をエレクトロに私達の無力のために可能ではないetinal細胞。しかし、外植片の in vivoおよびゼブラフィッシュ網膜におけるマウスの網膜にプラスミドをelectroporatingの成功は、それはまだゼブラフィッシュ21、22の可能性を示唆している。
この技術の強みの一つは、エレクトロポレーションが効率的に異なる網膜細胞の種類のすべてにモルホリノを導入するように見えるです。しかし、ある潜在的な弱点は、エレクトロポレーションが効率的にのみ背と網膜中心領域にモルホリノを納入ということでした。すべてのレイヤーが、しばしば損傷の結果にターゲティング良いの網膜の結果の腹側半分に向かって第二エレクトロポレーションイベント。この空間的制約はおそらく、電極の形状と配置によるものであった。眼の周囲に配置することができるカスタム設計されたカップ状電極の使用は、この弱点が改善されることがあります。モルホリノ配信のこの空間的な制限は、この技術の使用を制限し、アッセイの成功の使用を排除網膜のグローバルな評価を必要とするERGの分析としてH。それはどんなモルホリノ実験と同様に、それが標的mRNAの二番目の非重複モルホリノを使用して、結果を確認することをお勧めであることに留意すべきである。場合によっては、それはまた、二つの異なるタンパク質の発現をノックダウンするために同時に二つの異なるモルフォをエレクトロすることが可能です。我々は、個別におよび組み合わせ18、Pax6aとPax6bタンパク質の両方の発現をノックダウンすることによってこれを実証。
我々は、光損傷モデルでは、このテクニックを使用することを示したが、それはおそらく他の損傷のモデル2-8の再生を研究するために使用されるか、または破損していない網膜のタンパク質の機能を調べるために使用することができる。例えば、モルフォのエレクトロポレーションは、神経節やアマクリン細胞でノックダウンするために特定のチャネルやシグナル伝達分子の発現を使用して、これらのシグナル伝達の機能を研究することができます視覚処理の経路。しかし、モルフォは、新しいタンパク質の翻訳に影響を与えるとして、一つは分析が実行される前に内因性タンパク質の代謝回転が発生するまで待つ必要があります。タンパク質の安定性に応じて、それは数時間から数日〜18の範囲があります。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、ゼブラフィッシュの彼らの手入れや、保守のためにゼブラフィッシュの研究スタッフのためにFreimannライフサイエンスセンターとセンターに感謝します。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 14095 | Any #5 tweezers with work |
Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments | Blade: 500314 Handle: 500317 |
|
Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton company | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 |
Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |