Summary
Une méthode pour l'expression conditionnelle knockdown une protéine cible dans la rétine de poisson zèbre adulte est décrite, qui consiste à injecter par voie intravitréenne morpholinos antisens et les électroporation dans la rétine. La protéine résultante est assommée pendant plusieurs jours, ce qui permet de tester le rôle de la protéine dans la régénération ou de la rétine intacte.
Abstract
Beaucoup dévastatrices maladies oculaires héréditaires conduire à la cécité progressive et irréversible parce que les humains ne peuvent se régénérer mourants ou malades neurones rétiniens. En revanche, la rétine de poisson zèbre adulte possède la capacité robuste pour régénérer spontanément toute catégorie de neurones qui se perd dans une variété de différents modèles de lésions de la rétine, y compris la ponction de la rétine, l'ablation chimique, concentrées à haute température, et traitement par la lumière intense 1-8. Notre laboratoire largement caractérisé la régénération des photorécepteurs après un traitement intense de lumière constante et intérieure neurones rétiniens après l'injection intravitréenne ouabaïne 2, 5, 9. Dans tous les cas, un résident gliales Müller réintégrer le cycle cellulaire pour produire des progéniteurs neuronaux, qui continuent à proliférer et à migrer vers la couche appropriée de la rétine, où ils se différencient en neurones déficients.
Nous avons caractérisé cinq étapes différentes au cours de la régénération de la lumière-damarétine GED qui ont été mises en évidence par les réponses spécifiques cellulaires. Nous avons identifié plusieurs gènes différentiellement exprimés à chaque étape de la régénération de la rétine par l'analyse des microréseaux d'ARNm 10. Beaucoup de ces gènes sont également essentiels pour le développement oculaire. Pour tester le rôle de chaque gène candidat / protéine pendant la régénération de la rétine, nous avions besoin pour développer une méthode pour conditionnellement limiter l'expression d'une protéine unique candidat à la fois pendant la régénération de la rétine adulte.
Oligos morpholino sont largement utilisées pour étudier la perte de fonction des protéines spécifiques lors du développement du poisson zèbre, xénope, poulet, la souris et des tumeurs dans les xénogreffes humaines 11-14. Ces paires de bases modifiées oligos avec l'ARN de séquence complémentaire à bloquer l'épissage ou la traduction de l'ARN cible. Morpholinos sont stables dans la cellule et peut éliminer ou l'expression des protéines "knockdown" pendant trois à cinq jours 12.
Ici,Nous décrivons une méthode de manière efficace l'expression des protéines cibles knockdown dans la rétine de poisson zèbre adulte. Cette méthode emploie lissamine-tagged morpholinos antisens qui sont injectés dans le corps vitré de l'œil de poisson zèbre adulte. En utilisant une pince électrode, le morpholino est alors électroporés dans tous les types cellulaires de la rétine dorsale et centrale. Lissamine fournit la charge sur le morpholino pour l'électroporation et peuvent être visualisées à évaluer la présence de la morpholino dans les cellules de la rétine.
Knockdown conditionnelle dans la rétine peut être utilisé pour examiner le rôle des protéines spécifiques à différents moments pendant la régénération. De plus, cette approche peut être utilisée pour étudier le rôle des protéines spécifiques de la rétine intacte, dans les processus tels que la transduction visuelle et le traitement visuel dans les neurones de second ordre.
Protocol
1. Préparation de morpholino:
- Tous les oligos morpholino devrait être conçu sur mesure et commandés par l'intermédiaire GeneTools (Philomath, OR). Nous utilisons les chargés positivement lissamine-tagged morpholinos pour conduire le morpholinos électroporées vers l'électrode négative. Nous avons essayé, en vain, de cibler chargés négativement marqués à la fluorescéine morpholinos à l'électrode positive en utilisant cette technique. Diluer 300 nmol de morpholino en 100 pl d'eau sans nucléase pour obtenir une solution 3 mM. Aliquoter le morpholino en plusieurs microtubes paraffine scellés. Stocker à l'écart de la lumière à température ambiante.
- Déterminer la concentration morpholino en diluant 5 ul de morpholino (ou de l'eau utilisée pour diluer le morpholino comme une vierge) dans 95 ul de 0,1 N HCl. Régler la longueur d'onde du spectrophotomètre (λ) à 265 nm. Calculer la constante de votre morpholino utilisant l'équation suivante:
Constante = poids moléculaire particulière à votre morpholino X absorbance 1000/molar. - Vous trouverez le poids moléculaire et les données d'absorbance molaire sur les "Propriétés Oligo« feuille fournie avec chaque morpholino. Analyser le blanc afin de vérifier les lectures de base et de prendre des lectures de chaque dilution morpholino. Multipliez l'absorption à 265 nm de chaque morpholino par sa constante déterminée et par le facteur de dilution pour obtenir la concentration en ng / ul. Divisez ce chiffre par le poids moléculaire pour déterminer la concentration en mM. Diluer le morpholino, si nécessaire, à une concentration de travail.
2. Retirez la couche extérieure de cornée:
- Anesthetize mois 6-12 adulte poisson zèbre vieux tricaïne ou 2-phénoxyéthanol à 1,0 mg / ml dans l'eau du réservoir du poisson zèbre.
- Enveloppez le poisson zèbre dans un morceau de serviette humidifiée papier, couvrant les branchies, mais en laissant l'œil exposé. Le poisson enveloppé est placé sous un stéréoscope et le grossissement est augmentée jusqu'à ce que le diamètre de l'œil se remplit d'environ un tiers desle champ visuel (figure 1).
- Utiliser Dumont # 5 pinces, attrapez la cornée extérieure près de la fissure optique. Ce tissu est coloré en rouge et est étiqueté «OC» dans la figure 1. Il ya une légère saillie ou la lèvre indiqué par la flèche étiquetée «CL». Tirez à un angle faible (10 degrés) à travers l'œil pour enlever la cornée externe. Avec la pratique, cela peut être complété en un seul mouvement. Si le bordereau de pinces à épiler, re-saisir les tissus et tirez à nouveau à un angle faible jusqu'à leur suppression. Une cornée bien attachés peuvent causer l'œil pour être délogé de la prise lorsqu'il est tiré. Vous pouvez garder l'œil de devenir délogé par stabilisation avec un autre jeu de pinces à épiler.
3. Incision de la cornée et l'injection de morpholino:
- Immédiatement après l'enlèvement de la cornée externe, faire une petite incision dans la cornée, où l'élève satisfait aux iris (figure 2). Ceci est fait en utilisant une lame de bistouri saphir (voir Matériel).
- Charge 0,5 pl de la solution 3,0 mM dans un morpholino Hamiltsur la seringue équipée d'une jauge de 33 amovible, à bout émoussé l'aiguille (voir Matériel). Pipeter haut et bas pour éliminer les bulles d'air dans la ligne. Insérez soigneusement l'aiguille dans le corps vitré dans l'incision (figure 2). Ne pas insérer l'aiguille trop loin ou vous percer la rétine ou le déplacement de la lentille.
- Injecter lentement la solution morpholino dans l'espace vitré. Selon l'âge des poissons, l'espace vitré tiendra ~ 0,5 pi. Vous devriez visualiser vitreuse incolore qui fuit hors de l'incision comme il est déplacé par la solution morpholino. Injecter jusqu'à ce qu'une petite quantité de solution de fuites morpholino hors de l'incision. Vous devriez visualiser clairement les lissamine-tagged morpholino intérieur de l'œil.
- Après l'injection, le retour des poissons dans le réservoir pour récupérer. Nous habituellement seulement d'injecter de l'œil gauche, en utilisant l'œil droit comme un contrôle non-injecté, mais l'électroporation des deux yeux est possible.
4. L'électroporation:
- Suitel'injection d'environ 10 poissons, re-anesthésier un poisson injecté et l'envelopper dans un morceau de serviette en papier humide, couvrant juste les branchies, mais en laissant l'œil exposé. Transférer le poisson à une boîte de Pétri. Mettez des gants en latex ou similaire afin d'éviter l'exposition à l'anesthésie. Tout doucement tenant le poisson au fond du plat, remplir la cuve avec l'anesthésie (figure 3, panneau de gauche).
- Une électrode de 3 mm de diamètre en platine plaque (voir Matériel) localise les impulsions d'électroporation à environ la moitié de la rétine. Nous visent généralement la rétine dorsale. Appuyez doucement sur l'électrode positive à la baisse sur la moitié ventrale de l'œil. Avec l'externe de la cornée retirée, l'oeil est facilement tourné, exposant la partie dorsale du globe oculaire.
- Alors qu'il était encore en appuyant sur la face ventrale de l'œil, placer l'électrode négative à proximité de (~ 1 - 2 mm) la moitié exposée dorsale de l'œil. Soyez prudent de ne pas toucher l'électrode négative directement à l'œil, qui se traduira par endommagerla rétine dorsale. Une fois que vous déterminer la distance appropriée entre les électrodes, utiliser la vis de réglage sur la poignée des électrodes pour maintenir cette diffusion lors électroporation. Cela maintient l'électrode négative une distance optimale de l'oeil lorsque l'électrode positive est enfoncé en position.
- Électroporation l'œil en utilisant un Electroporateur CUY21 Square Wave (voir Matériel). Les paramètres d'électroporation doit être réglé sur deux années consécutives de 50 ms impulsions, à 75 V avec une pause de 1 seconde entre les impulsions.
- Retour du poisson dans le réservoir. En général, nous commençons notre protocole pour constante induite par la lumière la dégénérescence rétinienne, immédiatement après l'électroporation.
5. Les résultats représentatifs:
- Pour 3-5 jours après l'électroporation (en fonction de la stabilité de la morpholino), l'étiquette lissamine peuvent être visualisées dans toutes les couches de la rétine dans une rétine sectionnés (figure 4). Cela sert comme une confirmation de la présence del'étiquette morpholino.
- Nous pouvons atteindre knockdown protéine complète jusqu'à 3-5 jours après l'électroporation, en fonction de l'efficacité de la morpholino (figure 5). Typiquement, au cours d'études traitement par la lumière, nous récoltons les yeux à 3 ou 4 jours après l'électroporation morpholino. Ceci est fait en enlevant l'œil entier avec une pince Dumont 5B # avec des extrémités incurvées (figure 6; Matériaux) et le traitement des tissus pour l'immunohistochimie 15. Comme avec n'importe quelle technique knockdown, une démonstration de knockdown efficaces doivent être indiqués afin de valider le phénotype. Par conséquent, nous vous suggérons d'obtenir des antisérums pour votre protéine d'intérêt. Alternativement, si et les anticorps ne sont pas disponibles et le morpholino est dirigée soit à la accepteur d'épissage ou le site des donateurs dans le pré-ARNm, il va bloquer l'épissage de l'ARNm de l'efficacité. Dans ce cas, il est possible d'utiliser de la transcriptase inverse-PCR pour amplifier les séquences flanquantes dans l'ARN morphant et de déterminer l'efficacité du blocage des splic normalemotif de ING.
- Lorsque les rétines sont sectionnés à partir nasale temporelles sur l'axe dorsal ventral, les cases en bleu (figure 6) représentent les zones de la rétine qui sont le plus souvent endommagés par l'événement lui-même l'électroporation. La case grisée rose représente la zone qui est ciblé pour l'introduction dans les cellules rétiniennes morpholino par l'électroporation.
Figure 1. Schéma illustrant le retrait des couches épithéliales de la cornée. Le panneau de gauche montre les principales caractéristiques structurelles de l'œil, y compris la lentille (L), le corps vitré (Vit), de la rétine (R), l'externe de la cornée (OC), la cornée interne (IC), et la protubérance cornée ( CL). L'orientation de l'oeil est montré dans le coin inférieur droit du premier panneau et est étiqueté antérieure (A), postérieur (P), dorsale (D) et ventrale (V). La coloration rouge indique l'externe de la cornée qui est retiré. Le bac secondes el montre comment la pince sont utilisées pour saisir la saillie de la cornée et de tirer la cornée externe à travers l'œil à un angle faible (troisième groupe). Le panneau de droite montre comment une deuxième paire de pince peut être utilisée pour stabiliser l'œil tout en tirant la cornée.
Figure 2. Schéma des étapes impliquées dans l'injection intravitréenne de morpholino. Une petite incision est faite dans l'œil, où l'élève satisfait aux iris (panneau de gauche). L'écart résultant devrait être juste assez grand pour une aiguille de calibre 33, qui est rempli avec la solution morpholino, à insérer (panneau du milieu). Injecter lentement 0,5 ul de la solution dans le corps vitré (à droite). Vous devriez visualiser une petite quantité de solution vitréenne de sortir de l'incision que le vitré est partiellement remplacé par des lissamine-tagged morpholino (panneau de droite).
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Figure 3. Schéma de la procédure d'électroporation général. Les poissons anesthésiés, ce qui a été injecté par voie intravitréenne avec le morpholino, est doucement enveloppé dans une serviette en papier humide (panneau de gauche). La serviette en papier devrait couvrir les branchies, mais pas obstruer l'oeil (panneau du milieu). Appuyez doucement sur l'électrode positive vers le bas sur la partie ventrale de l'œil, permettant à la moitié dorsale de l'œil pour faire tourner hors de la douille. Placer l'électrode négative d'environ 1 mm de la moitié dorsale de l'œil et de commencer l'électroporation (panneau de droite).
Figure 4. Image confocale comparant une rétine électroporées sans intravitréenne injecter un morpholino lissamine-marqués (A), et une rétine par voie intravitréenne injecté et l'électroporation avec morpholino lissamine-marqués (B). L'étiquette lissamine se retrouve dans toutes les couches de la rétine et des types de cellules. ROS, tige extérieuresegments; ONL, couche nucléaire externe; INL, couche nucléaire interne; GCL, couche des cellules ganglionnaires.
Figure 5. Confocale images comparant immunolocalisation PCNA dans les rétines électroporation avec un morpholino témoin (à gauche) et rétines électroporation avec une morpholino anti-PCNA (panneaux de droite) avant induite par la lumière la mort cellulaire des photorécepteurs. Adaptés à l'obscurité de poisson zèbre adulte albinos ont été placés dans une lumière intense constante pour 1, 2 ou 3 jours après l'électroporation du morpholino. Le morpholino de contrôle ont échoué à réprimer l'expression de PCNA croissante dans les rétines endommagées-lumière. Le morpholino anti-PCNA efficacement renversé l'expression des protéines PCNA travers trois jours de dégâts de lumière constante intense.
Schéma Figure 6. (Panneau de gauche) montrant l'énucléation de l'œil pour processing et cryosectioning, qui se fait le long de l'axe dorsal ventral. La boîte rose ombragé (panneau de droite) montre la région de la rétine avec la plus grande quantité de protéines knockdown utilisant cette technique. Les cases bleues ombrées représentent les zones qui sont le plus souvent endommagés par l'événement électroporation. L'orientation de l'oeil est étiqueté antérieure (A), postérieur (P), dorsale (D) et ventrale (V).
Discussion
Récemment, deux analyses microarray a examiné les changements d'expression génétique qui s'est produite lors de la régénération de la rétine soit endommagée lumière ou un patch excisés chirurgicalement-rétinien 10, 16. Les deux études ont révélé de nombreux gènes qui présentaient d'importants changements dans l'expression, soit en augmentant ou en diminuant, que vraisemblablement sont nécessaires pour les différents événements qui se produisent lors de la régénération de la rétine, comme la rentrée de la glie Müller dans le cycle cellulaire, la prolifération et la migration continue de la progéniteurs neuronaux à la couche endommagée de la rétine, et la différenciation des progéniteurs neuronaux dans le type de cellules neuronales correcte. Bien qu'une comparaison directe de ces données de biopuces deux ensembles révèlent les gènes candidats qui pourraient être impliqués dans ces événements cellulaires, finalement ces gènes et leurs protéines codées doivent être testés afin de déterminer si elles sont nécessaires pour la régénération neuronale. Ici, nous décrivons un puissant de perte de fonction d'approche aux conditioprotéines knockdown Nally d'intérêt dans la rétine de poisson zèbre adulte. Cette technique a été utilisée pour étudier les protéines extracellulaires et intracellulaires, ainsi que des molécules de signalisation, des facteurs de transcription et des protéines nécessaires à 17-19 réplication de l'ADN. Ainsi, cette méthode a grandement facilité notre compréhension du mécanisme moléculaire qui sous-tendent les adultes de régénération de la rétine chez le poisson zèbre.
Nous avons testé plusieurs paramètres d'électroporation (tension, le nombre d'impulsions, le temps entre les impulsions) avant un protocole a été réalisé avec succès. Un précédent rapport de l'électroporation morpholinos dans la nageoire caudale de poisson zèbre régénérant utilisé 10 impulsions à basse tension (15 V) 20. Parce que la rétine de poisson zèbre adulte est entouré par des couches cellulaires multiples et ne sont pas facilement accessibles aux électrodes pince à épiler, les paramètres utilisés dans la nageoire ont échoué à l'électroporation efficace morpholinos dans la rétine adulte. Inversement, une haute tension (100 V), souvent resulted dans la mort des poissons. Récemment, 5 impulsions de 80 V a été décrit pour électroporer ADN plasmidique dans la rétine de souris nouveau-nés chiot 21. Nous avons constaté qu'un peu moins deux impulsions intenses de 75 V abouti à l'électroporation réussie de la morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte avec la survie de 100% des poissons traités. De plus, nous avons découvert que la suppression de la plupart des extérieurs (ou externe le plus) composante de la cornée grandement augmenté l'efficacité d'électroporation. Accroître le nombre d'impulsions peut éliminer le besoin pour l'enlèvement de ce tissu, mais peut aussi causer des dommages plus les tissus. Des études ont démontré un contrôle étendu que ces paramètres n'a pas causé la mort des cellules rétiniennes importantes ou de modifier les réponses cellulaires spécifiques observés pendant la régénération photorécepteur 19. Gain de fonction des études sont actuellement pas possible en utilisant cette technique in vivo, en raison de notre incapacité à constamment électroporation grandes acides ribonucléiques dans tous les rcellules etinal. Cependant, le succès de électroporation des plasmides dans la rétine de souris in vivo et de la rétine de poisson zèbre dans des explants de penser qu'il ya encore une possibilité chez le poisson zèbre 21, 22.
Un des points forts de cette technique est l'électroporation semble efficace introduire le morpholino dans tous les différents types de cellules rétiniennes. Cependant, une faiblesse potentielle, c'est que l'électroporation efficace livré le morpholino en seulement les régions dorsale et centrale de la rétine. Un événement électroporation seconde vers la moitié ventrale de la rétine dans les résultats un bon ciblage de toutes les couches, mais entraîne souvent des dommages. Cette restriction spatiale était probablement due à la forme et le placement des électrodes. L'utilisation d'électrodes de tasse conçu sur mesure en forme qui pourraient être placés autour de l'œil peut améliorer cette faiblesse. Cette restriction spatiale de la livraison morpholino limite l'utilisation de cette technique et exclut l'utilisation d'un dosage de succèsh que l'analyse de l'ERG qui exigerait une évaluation globale de la rétine. Il est à noter que, comme avec n'importe quelle expérience morpholino, il est conseillé de confirmer vos résultats en utilisant un second, sans chevauchement morpholino à l'ARNm cible. Dans certains cas, il est possible aussi d'électroporation deux morpholinos différents simultanément à knockdown l'expression de deux protéines différentes. Nous avons démontré cela en renversant l'expression à la fois des protéines et des Pax6a Pax6b, individuellement et en combinaison 18.
Bien que nous avons démontré l'utilisation de cette technique avec notre modèle de légers dommages, il pourrait probablement être utilisé pour étudier la régénération dans les modèles ou les autres dommages 2-8 utilisée pour examiner la fonction des protéines dans la rétine intacte. Par exemple, l'électroporation de morpholinos pourrait être utilisé pour knockdown l'expression des canaux ou de molécules spécifiques de transduction du signal dans le ganglion ou les cellules amacrines et ensuite étudier la fonction de ces signauxvoies dans le traitement visuel. Cependant, comme morpholinos affectent uniquement la traduction des protéines nouvelles, on aurait pu attendre le renouvellement des protéines endogènes se produit avant un test pourrait être effectué. Selon la stabilité de la protéine, qui pourrait varier de 18 heures à plusieurs jours.
Disclosures
Nous n'avons rien à divulguer
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les Freimann Life Science Center et le Centre pour le personnel de recherche Zebrafish pour leurs soins et l'entretien du poisson zèbre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | Any #5 tweezers with work |
| Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments, Inc. | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
| Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments, Inc. | Blade: 500314 Handle: 500317 | |
| Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton Co | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 | Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |
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