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Neurosciences

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Published: February 07, 2012
doi:
10.3791/3622
,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,Rice University

Summary

Ein Ansatz zur Analyse von Migration und schließlich das Schicksal der aviären Neuralleistenzellen in Wachtel-Küken chimären Embryos beschrieben wird. Diese Methode ist eine einfache und unkomplizierte Technik zum Aufspüren Neuralleistenzellen während der Migration und Differenzierung, die sonst schwer zu unmanipulierten innerhalb eines Hühnerembryo zu unterscheiden sind.

Abstract

Vogelembryonen bieten eine einzigartige Plattform für die Erforschung von vielen Wirbeltieren Entwicklungsprozesse durch die gute Anbindung der Embryonen im Ei. Chimäre Vogelembryonen, in denen Wachteln Spendergewebe in einen Hühnerembryo in ovo transplantiert wird, verbinden die Kraft der unauslöschliche genetische Markierung von Zellpopulationen mit der einfachen Handhabung durch den Vogelembryo vorgestellt.

Wachtel-Küken Chimären sind ein klassisches Instrument zur Nachverfolgung von wandernden Neuralleistenzellen (NCC) 1-3. NCCs sind eine vorübergehende wandernden Population von Zellen im Embryo, die im dorsalen Bereich der Entwicklung von neuronalen Rohr 4 stammen. Sie durchlaufen eine epitheliale zu mesenchymale Transition und in der Folge auch auf andere Regionen des Embryos, wo sie sich unterscheiden in verschiedene Zelltypen, einschließlich Knorpel 5-13, Melanozyten 11,14-20, 21-32 Neuronen und Glia zu migrieren. NCCs sind multipotente, und ihr Schicksal ist beeinbeeinflusst durch 1) die Region des Neuralrohrs in dem sie ihren Ursprung entlang der rostro-caudale Achse des Embryos 11,33-37, 2) Signale von benachbarten Zellen, wie sie 38 bis 44 zu migrieren, und 3) der Mikroumgebung ihre ultimative Ziel innerhalb des Embryos 45,46. Tracing diese Zellen von ihrem Entstehungsort im Neuralrohr, um ihre endgültige Position und Schicksal innerhalb des Embryos, liefert wichtige Einblicke in die Entwicklungsprozesse, die Musterbildung und Organogenese zu regulieren.

Die Transplantation von komplementären Regionen der Spender Neuralrohr (homotop Transplantation) oder verschiedenen Regionen des Spenders Neuralrohr (heterotope Transplantation) kann zeigen Unterschiede in der Pre-Spezifikation von NCCs entlang der rostro-caudale Achse 2,47. Diese Technik kann angepasst werden, um eine einseitige Kammer des Neuralrohrs, so dass eine Seite von Spendergewebe abgeleitet transplantiert, und die Gegenseite Reste in der ungestörten Wirtsembryo, yiElding eine interne Kontrolle innerhalb der gleichen Probe 2,47. Es kann auch für die Transplantation von Gehirn-Segmente in späteren Embryonen angepasst werden, nachdem HH10, wenn die vordere Neuralrohr 47 geschlossen ist.

Hier berichten wir über Techniken zur Erzeugung von Wachtel-Küken Chimären über Neuralrohr Transplantation, die für die Rückverfolgung der wandernden NCCs aus einer diskreten Segment des Neuralrohrs ableiten lassen. Artspezifische Etikettierung der Spender stammenden Zellen mit dem Wachtel-spezifische Antikörper QCPN 48-56 erlaubt dem Forscher, Spender-und Wirtszellen bei der experimentellen Endpunkt unterscheiden. Diese Technik ist einfach, kostengünstig und hat viele Anwendungen, einschließlich Schicksal-Mapping, Zelllinie Rückverfolgung und Identifizierung von Pre-Events Musterbildung entlang der rostro-kaudalen Achse 45. Wegen der Leichtigkeit des Zugangs zu den Vogelembryo, kann die Wachtel-Küken-Graft-Technik mit anderen Manipulationen, auch kombiniert werden, aber nicht auf die Linse Ablation 4 begrenzt0, Injektion von inhibitorischen Moleküle 57,58, oder genetische Manipulation mittels Elektroporation von Expressionsplasmiden 59-61, um die Reaktion des bestimmten wandernden Ströme von NCCs auf Störungen in der embryonalen Entwicklung Programm zu identifizieren. Darüber hinaus kann diese Pfropfen Technik auch verwendet, um andere interspezifische chimären Embryonen wie Wachtel-Enten-Chimären zu erzeugen, um NCC Beitrag zur kraniofazialen Morphogenese, oder Maus-Chimären-Küken, die Macht der Maus-Genetik mit der Leichtigkeit der Manipulation des Vogelembryo kombinieren studieren werden . 62

Protocol

1. Inkubieren Küken und Wachteleier auf die gewünschte Stufe Für HH9 Embryonen, reichen typische Inkubationszeit von 29 bis 33 Stunden bei 38 ° C 63 Waschen Sie alle Fremdkörper aus den Eiern mit lauwarmem Wasser. Vereinbaren Hühnereiern auf Tablett horizontal. Markieren Sie die Seite nach oben mit Bleistift, dies wird in die Region, wo der Embryo lokalisiert werden entsprechen wird. Inkubieren Wachteleier stumpfen Ende auf. Place in 38 ° C be…

Discussion

Das Pfropfen von der Wachtel Neuralrohr in Host Hühnerembryonen hier beschriebene ist eine unkomplizierte und kostengünstige Technik zur Verfolgung spezifischer Subpopulationen von Migration ausgehen NCCs aus verschiedenen Regionen entlang der rostro-caudale Achse 21,67-69. Diese Technik nutzt die Erleichterung des Zugangs zu Vogelembryonen (im Gegensatz zu Säugetierembryos Vergleich) und mit anderen Techniken, wie Gewebeablation, Injektion von inhibitorischen Moleküle, oder genetische Manipulation mittel…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich die Mitglieder des Lwigale Labor für die Kritik des Manuskripts. SLG wird von einem Ruth L. Kirschstein NRSA Stipendium des National Eye Institute (F32 EY02167301) unterstützt. PYL wird vom National Eye Institute (EY018050) unterstützt.

Materials

Reagent Company Catalog number
Chick eggs Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX.  
Quail eggs Various – we use Ozarks Egg Company, MO.  
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) www.poultrysupply.com 1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated Fine Science Tools 11210-10
Scotch tape Any office supply store  
Curved Iris forceps Fine Science Tools 11065-07
India ink Any art supply store  
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR International 101447-068
Clear Packing tape Any office supply store  
Needle pulling apparatus Narashige, Japan PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube Kimble chase 34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) Sigma-Aldrich A5177-52A
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter VWR International AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder) Fine Science Tools 26018-17
QCPN antiserum Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) Invitrogen A21125
Ringer’s Solution (2L):
  • 14.4g NaCl
  • 0.34g CaCl2
  • 0.74g KCl
  • 0.230g Na2HPO4
  • 0.04g KH2PO4
  • ddH2O to 2L
  • Filter and autoclave
 All reagents from Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0
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Neural Crest MigrationDifferentiationCross-species TransplantationAvian EmbryosQuail-chick ChimerasMigratory Neural Crest CellsEpithelial To Mesenchymal TransitionCell TypesCartilageMelanocytesNeuronsGliaMultipotent CellsRostro-caudal AxisNeighboring CellsMicroenvironmentPatterningOrganogenesis
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Griswold, S. L., Lwigale, P. Y. Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation. J. Vis. Exp. (60), e3622, doi:10.3791/3622 (2012).
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