الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

Summary

نبدي التجمع وتطبيق جهاز الجزيئية النطاق مدعوم من البروتين topoisomerase. وبناء عبارة عن مستشعر الحيوية الجزيئية التي تصف نوعان رئيسيان من فواصل الحمض النووي في أقسام الأنسجة عن طريق ربط two fluorophores مختلفة لتحقيق غاياتهم.

Abstract

طبيعيا الحيوية الجزيئية آلات العمل في كل خلية حية وعرض مجموعة متنوعة من تصاميم ^1-6. بعد تطوير مراكز صناعية آلات جزيئية على أجهزة قادرة على الحركة الاتجاه ، أي المحركات الجزيئية ، وعلى أجزاء مصغرة من الميكانيكية (العجلات ، الخ axels المعلقات ، و) ^7-9. هذا يقلد آلات الكلي ، على الرغم من أن الخصائص الفيزيائية الأساسية لهذه الأجهزة ، مثل الجمود والحفاظ على الزخم ، ليست صالحة للاستعمال في البيئات nanoworld ^10. ويمكن لتصاميم بديلة ، والتي لا تتبع مخططات macromachines الميكانيكية واستخدام الآليات المتقدمة في تطور الجزيئات البيولوجية ، والاستفادة من الشروط المحددة للnanoworld. الى جانب ذلك ، التكيف مع الجزيئات البيولوجية الفعلية لأغراض تصميم نانو يقلل المخاطر المحتملة لمنتجات تكنولوجيا النانو قد تشكل. نحن هنا لشرح التجمع وتطبيق واحد بناء الحيوية مكن من هذا القبيل ، كماEMI – الجزيئية الاصطناعية الجهاز الذي يجمع بين جهاز طبيعيا مع مكونات جزيئية اصطناعية. من وجهة نظر علم الإنزيمات ، وبناء لدينا هو مصمم الفلورسنت انزيم الركيزة المعقدة وضعت معا لأداء وظيفة محددة مفيدة. هذا التجمع هو تعريف الجهاز الجزيئي ، كما يحتوي على واحد ^12. حتى الآن ، والتكامل مع الجزء هندسيا — دبوس الشعر المزدوج فلوري — إعادة توجهها إلى مهمة جديدة من الحمض النووي من التلف العلامات ^12.

بناء تجمع لدينا من أصل 32 – DNA مير وtopoisomerase الوقس أنا انزيم (VACC TOPO). الجهاز ثم يستخدم المواد الخاصة بها الى افتعال حدتين كاشف fluorescently المسمى (الشكل 1). واحدة من وحدات (مخضر) يحمل VACC TOPO المرفقة تساهميا ل3'end وحدة أخرى (أحمر مضان) هو منعطف حاد الحرة مع 3'OH المحطة. وحدات قصيرة الأجل ويحشدوا بسرعة مرة أخرى إلى بناء الأصلي ، الذي recleaves في وقت لاحق.في غياب الحمض النووي فواصل هاتين الوحدتين منفصلة religate باستمرار وبطريقة دورية. في أقسام الأنسجة مع الحمض النووي من التلف ، وحدة للكشف عن topoisomerase الحاملة تعلق الحمض النووي بشكل انتقائي للفواصل حادة مع 5'OH العضوية (من النوع الثاني الدناز فواصل) ^11،12 ، ووضع العلامات fluorescently لهم. الثانية ، انزيم خالية القاسي تشكلت بعد قليل النوكليوتيد الانقسام ، وسوف ligate لكسر 5'PO كليلة العضوية ₄ (I – الدناز نوع فواصل) ^11،12 ، إذا T4 يغاز الحمض النووي موجود في حل ^13،14. عند إضافة T4 يغاز الحمض النووي لقسم الأنسجة أو محلول يحتوي على الحمض النووي مع فواصل حادة العضوية 5'PO ₄ ، يغاز يتفاعل مع الحمض النووي تنتهي 5'PO ₄ ، وتشكيل شبه مستقرة انزيم الدنا المجمعات. سوف دبابيس الشعر كليلة العضوية تتفاعل مع هذه المجمعات الافراج يغاز دبابيس الشعر ، وربط تساهميا إلى الحمض النووي ، وبالتالي وضع العلامات 5'PO ₄ فواصل الحمض النووي كليلة العضوية.

هذا التطور تجسد نهجا جديدا لعملية ال(ه) من تصميم الآلات الجزيئية ويوفر جهاز استشعار مفيدة للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر في الخلايا والأنسجة الثابتة.

Protocol

وينبغي أن تكون على استعداد للكشف عن أجزاء الجهاز المستندة الجزيئية أولا لأن إعدادها وقتا أكثر من تجميع الجهاز الجزيئي. وبناء يعمل بشكل جيد مع 5 أبواب 6μm سميكة من قطع بارافورمالدهيد الثابتة ، وكتل البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج. استخدام العلامات التجارية الشريحة ا?…

Discussion

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تجميع واستخدام الحمض النووي الوسم المزدوج استشعار الضرر. المجس هو آلة جزيئية مدفوعا الحيوية الجزيئية المحرك ، وهو فيروس ترميز TOPO VACC البروتين المرتبط مع مكونات اصطناعية. وقدم مثالا على تطوير نهج الحيوي الذي مكن دعاة تكييف الهياكل البي…

Materials

1. Xylene
2. 80 and 96% Ethanol.
3. 2% solution of bovine serum albumin (BSA) in distilled water.
4. Oligonucleotide 1: a double-hairpin, dual labeled with fluorescein and tetramethylrhodamine:

5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.

Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT

5. Oligonucleotide 3. Blunt-ended rhodamine-labeled hairpin for enhancement of in situ ligation signal with T4 DNA ligase: 5′-GCG CTA GAC CRG GTC TAG CGC-3′; R – Tetramethylrhodamine-dT
6. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) – 3000 U/μL (Vivid Technologies). In the initial experiments we used 215 pmoles (7.1 μg) of the VACC TOPO per every 25 μL of the reaction mix. However, the topoisomerase concentration can be significantly reduced without the loss of sensitivity. We later used a four times lesser amount of VACC TOPO per section (1.76 μg in 25 μL of the reaction mix per section) with similar results. Reducing amount of the enzyme to 880 ng (in 25 μL of the reaction mix) resulted in a weaker signal and 8.8 ng of VACC TOPO produced no detectable signal.
7. T4 DNA ligase 5 U/μL (Roche). This highly concentrated ligase preparation gives the best signal in our experimental conditions.
8. 10 x reaction buffer for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20° C) (Roche) . ATP in reaction buffer is easily destroyed in repetitive cycles of thawing-freezing. Aliquot the buffer in small 15-20 μL portions and store at – 20° C. Use once.
9. 30% (w/v) solution of PEG-8000 (Sigma) in bidistilled water. 15 % PEG-8000 in the reaction mix strongly stimulates the detection, increasing the effective concentrations of its constituents by volume exclusion.
10. Proteinase K (Roche) 20 mg/mL stock solution in distilled water. Store at – 20° C. In the reaction use 50mg/mL solution in PBS, prepared from the stock. Do not reuse.
11. Vectashield with DAPI (Vector Laboratories).
12. Sodium bicarbonate buffer: 50mM NaHCO₃, 15mM NaCl, pH 8.2.
13. 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.