בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ"א

Summary

אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של התקן מולקולרי בקנה מידה מופעל על ידי חלבון topoisomerase. לבנות הוא חיישן ביולוגי מולקולרי אשר תוויות שני סוגים עיקריים של הפסקות DNA בסעיפים רקמה על ידי מצרפת שניים fluorophores שונים למטרותיהם.

Abstract

באופן טבעי ביו מולקולרית מכונות לעבוד בכל תא חי להציג מגוון של עיצובים ^1-6. עם זאת, פיתוח של מכונות מולקולריות מרכזי מלאכותי על מכשירים המסוגלים תנועה כיוונית, כלומר מנועים מולקולריים, ועל חלקים מוקטנת שלהם מכני (גלגלים, axels, תליונים וכו ') ^7-9. זה מחקה את המאקרו מכונות, למרות התכונות הפיסיקליות חיוני עבור התקנים אלה, כגון אינרציה ושימור תנע, לא שמיש בסביבות nanoworld ^10. עיצובים חלופיים, אשר לא פעל תוכניות מכני macromachines ולהשתמש במנגנוני התפתח באבולוציה של מולקולות ביולוגיות, יכולים לנצל את התנאים הספציפיים של nanoworld. חוץ מזה, התאמת מולקולות ביולוגיות בפועל למטרות ננו עיצוב מפחית הסכנות הטמונות במוצרים ננוטכנולוגיה עשויה להוות. כאן אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של לבנות חיים ביו אפשרה כאלה, כמואמי-מלאכותי התקן מולקולרי המשלבת מכונה מולקולרית טבעיים המתחוללים עם מרכיבים מלאכותיים. מנקודת מבט enzymology, לבנות שלנו הוא מעצב פלורסנט אנזימים המצע מורכב להרכיב לבצע פונקציה שימושית ספציפית. הרכבה זו מעצם הגדרתה מכונה מולקולרית, כפי שהוא מכיל ^12. עם זאת, השילוב שלו עם החלק מהונדסים – סיכת ראש כפול פלורסנט – מחדש מכוון שזה משימה חדשה של תיוג נזק לדנ"א ^12.

לבנות שלנו מרכיב מתוך ה-DNA 32-mer ו אנזים vaccinia topoisomerase אני (VACC Topo). המכונה ואז משתמש בתוכן משלה לפברק שתי יחידות גלאי שכותרתו fluorescently (איור 1). אחת היחידות (פלואורסצנטי ירוק) נושא VACC Topo מחוברת קוולנטית אל 3'end שלה ליחידה אחרת (אדום פלואורסצנטי) היא סיכת חינם עם 3'OH סופנית. היחידות קצרת ובמהירות מחדש בחזרה לבנות המקורי, אשר לאחר מכן recleaves.בהעדר DNA הפסקות אלו שתי יחידות נפרדות ברציפות religate בצורה מחזורית. בקטעים רקמה עם נזק לדנ"א, יחידת topoisomerase נושאי גלאי סלקטיבי מייחסת בוטה, שהסתיימה עם הפסקות DNA 5'OH (DNase II מסוג הפסקות) ^11,12, fluorescently תיוג אותם. השני, אנזים ללא מכבנה נוצר לאחר מחשוף oligonucleotide, יהיה ולקשור את הפסקה 5'PO בוטה, הסתיים ₄ (DNase אני מסוג הפסקות) ^11,12, אם האנזים T4 DNA נמצא הפתרון ^13,14. כאשר האנזים T4 DNA הוא הוסיף קטע רקמה או פתרון המכילים DNA עם 5'PO ₄ קהה הסתיים הפסקות, האנזים מגיב עם 5'PO ₄ קצוות DNA, ויצרו חצי יציב אנזים-DNA קומפלקסים. סיכות הסתיים בוטה יקיימו אינטראקציה עם אלה מתחמי שחרור האנזים סיכות ו קוולנטית קישור ל-DNA, ובכך תיוג 5'PO ₄ בוטה-DNA הסתיימו הפסקות.

פיתוח זה מדגים גישה מעשית חדשה העיצוב דואר של מכונות מולקולריות ומספק חיישן שימושי עבור זיהוי של אפופטוזיס ו-DNA נזק בתאים וברקמות קבוע.

Protocol

סעיפים לאיתור מכונת מבוססי מולקולרית צריכים להיות מוכנים הראשון, כי ההכנה שלהם לוקח זמן רב יותר מאשר ההרכבה של המכשיר מולקולרית. לבנות עובד גם עם 5-6μm בעובי לחתוך קטעים מתוך paraformaldehyde-קבוע, פרפין, משובצים אבני רקמות. השתמש המותגים שקופיות אשר שומרים על החלקים היטב, כגו?…

Discussion

בסרטון הזה, אנו מראים כיצד להרכיב ולהשתמש כפול תיוג DNA חיישן נזק. החיישן הוא מכונה מולקולרית מונע על ידי מנוע ביו מולקולרית, וירוס המקודד חלבון VACC Topo מקושר עם מרכיבים מלאכותיים. הפיתוח המוצג מדגים גישה ביו מופעלת הדוגלת בהתאמת מבנים ביולוגיים, ארכיטקטורות בפועל חלקים…

Materials

1. Xylene
2. 80 and 96% Ethanol.
3. 2% solution of bovine serum albumin (BSA) in distilled water.
4. Oligonucleotide 1: a double-hairpin, dual labeled with fluorescein and tetramethylrhodamine:

5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.

Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT

5. Oligonucleotide 3. Blunt-ended rhodamine-labeled hairpin for enhancement of in situ ligation signal with T4 DNA ligase: 5′-GCG CTA GAC CRG GTC TAG CGC-3′; R – Tetramethylrhodamine-dT
6. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) – 3000 U/μL (Vivid Technologies). In the initial experiments we used 215 pmoles (7.1 μg) of the VACC TOPO per every 25 μL of the reaction mix. However, the topoisomerase concentration can be significantly reduced without the loss of sensitivity. We later used a four times lesser amount of VACC TOPO per section (1.76 μg in 25 μL of the reaction mix per section) with similar results. Reducing amount of the enzyme to 880 ng (in 25 μL of the reaction mix) resulted in a weaker signal and 8.8 ng of VACC TOPO produced no detectable signal.
7. T4 DNA ligase 5 U/μL (Roche). This highly concentrated ligase preparation gives the best signal in our experimental conditions.
8. 10 x reaction buffer for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20° C) (Roche) . ATP in reaction buffer is easily destroyed in repetitive cycles of thawing-freezing. Aliquot the buffer in small 15-20 μL portions and store at – 20° C. Use once.
9. 30% (w/v) solution of PEG-8000 (Sigma) in bidistilled water. 15 % PEG-8000 in the reaction mix strongly stimulates the detection, increasing the effective concentrations of its constituents by volume exclusion.
10. Proteinase K (Roche) 20 mg/mL stock solution in distilled water. Store at – 20° C. In the reaction use 50mg/mL solution in PBS, prepared from the stock. Do not reuse.
11. Vectashield with DAPI (Vector Laboratories).
12. Sodium bicarbonate buffer: 50mM NaHCO₃, 15mM NaCl, pH 8.2.
13. 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.