Nous démontrons l'assemblage et l'application d'un dispositif à l'échelle moléculaire alimenté par une protéine topoisomérase. La construction est un capteur bio-moléculaires dont les étiquettes deux grands types de cassures de l'ADN dans les coupes de tissus en attachant deux fluorophores différents à leurs extrémités.
Naturelle bio-moléculaire des machines de travail dans chaque cellule vivante et d'afficher une variété de modèles 1-6. Pourtant, le développement de centres de machines moléculaires artificielles sur des appareils capables de mouvement directionnel, c'est à dire les moteurs moléculaires, et sur leur échelle réduite des pièces mécaniques (roues, essieux, etc pendentifs) 7-9. Cette imite les machines macro-, même si les propriétés physiques essentielles pour ces appareils, tels que l'inertie et la conservation du moment, ne sont pas utilisables dans les environnements nanomonde 10. Conceptions alternatives, qui ne suivent pas les schémas mécaniques macromachines et utiliser des mécanismes développés dans l'évolution des molécules biologiques, peuvent profiter des conditions spécifiques du nanomonde. Par ailleurs, l'adaptation réelle des molécules biologiques aux fins de la nano-conception permet de réduire les dangers potentiels des produits des nanotechnologies peuvent présenter. Ici nous démontrons l'assemblage et l'application d'une telle bio-permis de construire, commeemi-artificiel appareil moléculaire, qui associe une machine naturelle moléculaire avec des composants artificiels. Du point de vue de l'enzymologie, notre construction est un concepteur fluorescents complexes enzyme-substrat mis ensemble pour remplir une fonction spécifique utile. Cet ensemble est par définition une machine moléculaire, car il contient un 12. Pourtant, son intégration avec la partie ingénierie – fluorescentes épingle double – le re-dirige vers une nouvelle tâche d'étiquetage 12 dommages à l'ADN.
Notre construire assemble d'un ADN de 32-mer et d'une enzyme topoisomérase I vaccine (VACC TOPO). La machine utilise alors son propre matériel pour fabriquer deux unités de détection marqués par fluorescence (figure 1). L'une des unités (fluorescence verte) effectue VACC TOPO covalente à son extrémité 3 'et une autre unité (fluorescence rouge) est une épingle à cheveux libres avec un 3'OH terminal. Les unités sont de courte durée et rapidement montés de nouveau dans la construction d'origine, qui recleaves ultérieurement.En l'absence d'ADN pauses ces deux unités séparées en continu et religate de façon cyclique. Dans des coupes de tissus avec des dommages à l'ADN, l'unité de détecteur de topoisomérase porteurs attache sélective aux cassures de l'ADN à bouts francs avec 5'OH (DNase II de type casse) 11,12, fluorescence leur étiquetage. La seconde, sans enzyme épingle formé après clivage oligonucléotidique, sera ligaturer à un 5'PO 4 à extrémité franche rupture (DNase I type pauses) 11,12, si l'ADN ligase T4 est présent dans la solution 13,14. Lorsque l'ADN ligase T4 est ajouté à une coupe de tissu ou d'une solution contenant de l'ADN avec des 5'PO 4 bouts francs pauses, la ligase réagit avec 5'PO 4 extrémités d'ADN, formant semi-stable enzyme-ADN. Les épingles à bouts francs vont interagir avec ces complexes libérant épingles ligase et lier de façon covalente à l'ADN, ce qui étiquetage 5'PO 4 cassures de l'ADN à bouts francs.
Ce développement illustre une nouvelle approche pratique pour ela conception électronique de machines moléculaires et offre un capteur utile pour la détection de l'apoptose et endommagent l'ADN dans les cellules et les tissus fixes.
Dans cette vidéo, nous démontrons comment assembler et à utiliser un capteur à double marquage de l'ADN des dommages. Le capteur est une machine moléculaire tirée par la bio-moléculaires moteur, un virus protéine codée VACC TOPO liés à des composants artificiels. Le développement a présenté illustre une approche bio-permis qui prône l'adaptation des structures biologiques, des architectures et des pièces réelles et des composants de cellules à la conception des dispositifs de non-toxique à l&#…
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par la subvention R01NS062842 de l'Institut national des troubles neurologiques et les accidents cérébrovasculaires, National Institutes of Health (VVD) et par des subventions R21 NS064403 de l'Institut national des troubles neurologiques et les accidents cérébrovasculaires, National Institutes of Health à l'ARRA (VVD) et R21 EB006301 Institut national d'imagerie biomédicale et bio-ingénierie, National Institutes of Health (VVD).
5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.
Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT