Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco
Summary
Isso detalhes o trabalho de preparação de fibrina scaffolds 3D para cultura e diferenciação das células-tronco plutipotent. Tais suportes podem ser usados para examinar os efeitos de vários compostos biológicos sobre o comportamento das células estaminais, bem como modificada para conter sistemas de entrega de drogas.
Abstract
As células estaminais são encontrados em que ocorre naturalmente microambientes 3D in vivo, os quais são muitas vezes referida como a célula nicho haste 1. A cultura de células-tronco dentro de 3D biomaterial andaimes fornece uma maneira para exatidão imitar estes microambientes, proporcionando uma vantagem sobre os métodos tradicionais de cultura 2D usando poliestireno, bem como um método para tecidos de engenharia de substituição 2. Enquanto polystrene cultura 2D tecido tem sido utilizada para a maioria das experiências de cultura de células, andaimes 3D biomaterial pode mais estreitamente replicar os microambientes encontrados in vivo, permitindo estabelecimento mais precisa da polaridade de células no meio ambiente e possuindo propriedades bioquímicas e mecânicas semelhantes a tecido mole. 3 A variedade de origem natural e andaimes biomaterial sintético têm sido investigados como ambientes 3D para apoiar o crescimento de células-tronco. Enquanto andaimes sintéticos podem ser sintetizados a ter uma maior range de propriedades mecânicas e químicas e muitas vezes têm uma maior reprodutibilidade, biomateriais naturais são frequentemente compostas de proteínas e polissacáridos encontrados na matriz extracelular e, como resultado contêm sítios de ligação para a adesão celular e prontamente suporte de cultura de células. Fibrina andaimes, produzido por polimerização do fibrinogénio proteína obtida a partir de plasma, têm sido amplamente investigados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos tanto de vitro como in vivo 4. Tais suportes pode ser modificada usando uma variedade de métodos para incorporar os sistemas de libertação controlada para a entrega de factores terapêuticos 5. O trabalho anterior mostrou que andaimes tais pode ser utilizado com sucesso para a cultura de células estaminais embrionárias e este sistema de cultura de andaime baseado pode ser usado para examinar os efeitos de vários factores de crescimento sobre a diferenciação das células-tronco semeadas dentro 6,7.
Este detalhes protocolo do processo de polymerizing de fibrina scaffolds a partir de soluções de fibrinogénio, usando a actividade enzimática da trombina. O processo leva 2 dias para se completar, incluindo um passo de diálise durante a noite para a solução de fibrinogénio para remover citratos que inibem a polimerização. Estes métodos detalhados contar com as concentrações de fibrinogênio determinados a ser o ideal para embrionário e induzida por cultura de células pluripotentes estaminais. Outros grupos têm investigado andaimes de fibrina para uma vasta gama de tipos de células e aplicações – demonstrando a versatilidade desta abordagem 8-12.
Protocol
Discussion
Este protocolo detalhado acima fornece um método para a geração de andaimes 3D de fibrina para a cultura de células estaminais pluripotentes, especificamente para o rato embrionário e células estaminais pluripotentes induzidas. Este sistema de cultura de 3D biomaterial baseado com mais precisão imita o nicho de células-tronco encontrada de vivo e, como resultado, pode ser utilizado para rastrear sinais biológicos para determinar os seus efeitos sobre a diferenciação de células-tronco …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer NSERC Discovery Grant 402462 "andaimes da engenharia de tecidos para controlar pluripotentes induzidas comportamento de células-tronco".
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
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