Ex-vivo-Mimikry von normalen und anormalen menschlichen Hämatopoese
Summary
Ein 3D-Kultur für Hämatopoese wird unter Verwendung von humanem Nabelschnurblut und leukämischen Knochenmarkszellen. Verfahren basiert auf der Verwendung eines porösen, synthetischen Polyurethan Gerüst mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet ist. Dieses Gerüst ist anpassbar an eine Vielzahl von Zellen aufnehmen.
Abstract
Hämatopoetischen Stammzellen erfordern eine einzigartige Mikroumgebung um die Bildung roter Blutkörperchen ein zu unterhalten; das Knochenmark (BM) ist eine komplexe dreidimensionale (3D) Gewebe, bei Hämatopoese wird durch räumlich organisiert zelluläre Mikroumgebung reguliert bezeichnet Nischen 2-4. Die Organisation der BM Nischen ist entscheidend für die Funktion oder Dysfunktion des normalen oder malignen BM 5. Deshalb ein besseres Verständnis für die in-vivo-Mikroumgebung mit einem Ex-vivo-Mimikry würde uns helfen, Aufklärung der molekularen, zellulären und Determinanten der Mikroumgebung Leukämogenese 6.
Derzeit werden hämatopoetischer Zellen in vitro in einem zweidimensionalen (2D) Gewebekulturflaschen / Well-Platten 7 erfordern entweder Co-Kultur mit allogenen oder xenogenen Stromazellen oder Zugabe von exogenen Zytokinen 8 kultiviert. Diese Bedingungen sind künstliche und unterscheiden sich von der in vivo </em> Mikroumgebung, dass sie nicht über die 3D-zellulären Nischen und entlarven die Zellen auf abnorm hohe Zytokin-Konzentrationen, die zur Differenzierung und zum Verlust der Pluripotenz 9,10 führen kann.
Hier präsentieren wir eine neuartige 3D-Knochenmark-Kultur-System, das die 3D simuliert in vivo das Wachstum und Umwelt unterstützt multilineage Hämatopoese in Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren. Die hoch porösen Gerüst in diesem System aus Polyurethan (PU) verwendet, ermöglicht eine hohe Dichte Zellwachstum über eine höhere spezifische Oberfläche als die herkömmliche 2D-Monolayer-Kultur in 11. Unsere Studien zeigen, dass dieses Modell das Wachstum von menschlichem Nabelschnurblut (CB) mononukleäre Zellen (MNC) 12 und primären leukämischen Zellen in Abwesenheit von exogenen Zytokinen unterstützt. Diese neuartige 3D-Mimikry bietet eine tragfähige Plattform für die Entwicklung eines menschlichen experimentelles Modell zur Blutbildung zu studieren und neuartige Behandlungsmöglichkeiten gegen Leukämie zu erforschen.
Protocol
Discussion
Die Ex-vivo-3D-Kultur hier vorgestellte System ermöglicht es uns, eine 3D-biomimicry der Blutbildung feststellen, dass der ursprüngliche BM rekapituliert Architektur und zelluläre Phänotyp unabhängig von exogenen Zytokinen. Das 3D-Modell stellt die Struktur und die Mikroumgebung, die normale und abnormale hämatopoetische Zellen unter Bedingungen ähnlich denen in vivo angetroffen vermehren können.
Die Auswahl der polymeren Trägermaterial zu vertreten ein entscheiden…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Richard Thomas Leukämie-Fonds, die Lady Tata Memorial Trust, das Northwick Park Hospital Leukämieforschung Treuhandfonds und des National Institute of Health Research (NIHR), UK finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue No |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 |
| PBS | Gibco | 14190-094 |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 |
| MTS | Promega | G3580 |
| Glutaraldehyde | Fluka Biochemika | 49624 |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10108-165 |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32272 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 |
| CD45-FITC | BD Pharmigen | 74895 |
| CD71-PE | BD Pharmigen | 555537 |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Pharmigen | 555570 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
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