Génération de cellules T régulatrices induites de l'homme primaires cellules T naïves et mémoire

Summary

Nous décrivons une méthode pour générer des cellules T régulatrices, de mémoire et naïve d'un donneur de sang humain unique. Polarisée Tregs peut être ensuite comparé à des sous-ensembles d'autres dans une variété d'applications génétiques et fonctionnelles avec une homogénéité génétique, y compris un test de suppression aussi détaillé ici.

Abstract

Le développement et la maintenance de CD4 ^{+ de} immunosuppresseurs des cellules T régulatrices (Treg) contribuer à la tolérance périphérique nécessaire pour rester dans l'homéostasie immunologique avec la grande quantité des antigènes du soi et commensaux à l'intérieur et sur ​​le corps humain. Perturbations de l'équilibre entre Tregs et inflammatoires cellules T conventionnelles peuvent entraîner immunopathologie ou le cancer. Bien que l'injection thérapeutique des Treg a été démontré pour être efficace dans des modèles murins de la colite ^1, diabète de type I ^2, la polyarthrite rhumatoïde et maladie du greffon contre l'hôte, ⁴ plusieurs différences fondamentales dans l'homme par rapport à la souris Treg biologie ⁵ a jusqu'à présent empêché l'utilisation clinique. L'absence d'un nombre suffisant, la pureté, la stabilité et la spécificité de ralliement de la thérapeutique Tregs a nécessité une plate-forme dynamique de développement humain, sur laquelle Treg afin d'optimiser les conditions de leur expansion ex vivo ^6.

Ici, nous D ÀEscribe une méthode pour la différenciation des lymphocytes T régulateurs induits (iTregs) à partir d'un seul donneur de sang périphérique humain qui peut être décomposé en quatre étapes: l'isolement de cellules mononucléées du sang périphérique, la sélection magnétique de cellules T CD4 ^+, dans la culture cellulaire in vitro et activé par fluorescence tri cellulaire (FACS) de sous-ensembles de lymphocytes T. Depuis la transcription Treg facteur de la signature P3 boîte de forkhead (FoxP3) est un facteur de transcription induite par activation chez les humains ⁷ et aucun autre marqueur unique existe, un panneau de combinatoire des marqueurs doit être utilisé pour identifier les cellules T avec une activité suppresseur. Après six jours de culture, les cellules de notre système peut être délimitée en cellules T naïves, les cellules T mémoires ou iTregs en fonction de leur expression relative de la CD25 et CD45RA. Comme les cellules T mémoires et naïves avoir des exigences différentes de polarisation signalés et plasticités ^8, pré-tri de la population de cellules T initial en CD45RA ⁺ et CD45RO ⁺ sous-ensembles peuvent be utilisé pour examiner ces divergences. Conformément à d'autres, notre CD25 ^Salut CD45RA ^– iTregs expriment des niveaux élevés de FoxP3 ^9, GITR et CTLA-4 ¹¹ et de faibles niveaux de CD127 ^12. À la suite FACS de chaque population, des cellules résultantes peut être utilisé dans un dosage suppresseur qui évalue la capacité par rapport à retarder la prolifération carboxyfluorescéine ester succinimidylique (CFSE)-marqué cellules T autologues.

Protocol

1. Isolement des cellules humaines mononucléaires du sang périphérique (CMSP) de couche leuco-plaquettaire Acquérir une unité de couche leuco-plaquettaire de l'hôpital ou à proximité emplacement en centre-sang. Notre centre de transfusion nous donne environ 40-60 ml de buffy coat unitaire obtenu à partir de donneurs de sang normaux. Verser le sang dans un autoclave 500 ml flacon en verre contenant du PBS stérile pour diluer couche leuco-plaquettaire. Le volume final de PBS manteau + bu…

Discussion

Alors que le transfert de Treg détient d'énormes promesses thérapeutiques dans la lutte contre le rejet de greffe auto-immunité et d'autres troubles immunitaires ou inflammatoires à médiation, les méthodes pour leur production efficace et un maintien stable n'ont pas encore été développé. Comme seulement 1-5% des cellules T humaines circulant sont Tregs, leur expansion contrôlée et la différenciation de surmonter ce manque comme un obstacle majeur de la mise en œuvre des Tregs dans la clinique…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Lymphoprep	Axis-Shield	1114547	Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge	Eppendorf	5810R
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	3110
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19052
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19157
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19155
The Big Easy EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18001	Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes	BD Falcon	352008
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes	VWR	89004-368
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes	BD Falcon	352059
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes	VWR	89004-364
Human anti-CD3 Antibody	Bio X Cell	BE0001-2	Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate	BD Falcon	353047
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate	Grenier Bio-One	650180
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer	Gibco	72400
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000
β-Mercaptoethanol	Sigma	M7522
Recombinant Human TGF-β1	eBioscience	14-8348-62
Recombinant Human IL-2	eBioscience	14-8029-63
Bovine Serum Albumin (BSA)	MP Biomedicals Inc.	810531
0.5 M EDTA	Amresco	E177
Mouse Anti-Human CD25-PE	Miltenyi Biotec	130-091-024	Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5	eBioscience	15-0458-42	Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC	Miltenyi Biotec	130-094-890	Clone: MB15-18C9
DNase II	MP Biomedicals Inc.	190370
MoFlo Flow Cytometer	Beckman Coulter
FlowJo Software	Tree Star, Inc.
Cell Quest Pro Software	BD Biosciences
Newborn Calf Serum	Gibco	16010
L-glutamine	Gibco	25030
AIM-V	Gibco	0870112
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Treg Suppression Inspector Beads	Miltenyi Biotec	130-092-909
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
40 μM Nylon Cell Strainer	BD Falcon	352340