Generering af inducerede regulatoriske T-celler fra primære humane naive og memory T-celler
Summary
Beskriver vi en fremgangsmåde til generering af regulering, hukommelses-og naive T-celler fra en enkelt human bloddonor. Polariseret tregs kan derefter sammenlignes med andre delmængder i forskellige genetiske og funktionelle anvendelser med genetisk ensartethed, herunder suppression assay også beskrevet her.
Abstract
Udvikling og vedligeholdelse af immunosuppressive CD4 + regulatoriske T-celler (tregs) bidrager til den perifere tolerance er nødvendig for at forblive i immunologisk homeostase med den store mængde af selvstændige og kommensale antigener i og på den menneskelige krop. Forstyrrelser i balancen mellem tregs og inflammatoriske konventionelle T-celler kan resultere i immunopatologi eller cancer. Selv terapeutisk injektion af tregs har vist sig at være effektiv i murine modeller af colitis 1, type I diabetes 2, rheumatoid arthritis og graft versus host-sygdom, 4 flere fundamentale forskelle i human versus muse Treg biologi 5 hidtil udelukket klinisk anvendelse. Manglen på tilstrækkeligt mange renhed, stabilitet og homing specificitet terapeutisk tregs nødvendiggjorde en dynamisk platform af human Treg udvikling som at optimere betingelserne for deres ex vivo-ekspansion 6.
Her d kanescribe en fremgangsmåde til differentiering af induceret tregs (iTregs) fra et enkelt humant perifert blod donor, som kan opdeles i fire faser: isolering af perifere mononucleære blodceller, magnetisk udvælgelse af CD4 + T-celler, in vitro celledyrkning og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) af T-celledelmængder. Idet Treg signaturen transkriptionsfaktoren gaffelhoved boks P3 (foxp3) er en aktiverings-induceret transkriptionsfaktor i mennesker 7 og ingen anden unik markør eksisterer et kombinatorisk panel af markører skal anvendes til at identificere T-celler med suppressor-aktivitet. Efter seks dage i kultur, kan celler i vores system kan afgrænses i naive T-celler, hukommelses-T-celler eller iTregs baseret på deres relative ekspression af CD25 og CD45RA. Som hukommelses-og naive T-celler har forskellige rapporterede polarisationsniveauer krav og plasticities 8, forsortering af den oprindelige T-cellepopulation i CD45RA + og CD45RO + delmængder kan Be bruges til at undersøge disse forskelle. I overensstemmelse med andre vores CD25 Hi CD45RA – iTregs eksprimerer høje niveauer af foxp3 9, GITR og CTLA-4 11 og lave niveauer af CD127 12. Efter FACS for hver population, kan resulterende celler anvendes i et suppressor assay, som evaluerer den relative evne til at forsinke udbredelsen af carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE)-mærkede autologe T-celler.
Protocol
Discussion
Mens Treg overførsel besidder enorm terapeutisk løfte i bekæmpelsen af autoimmunitet transplantatafvisning og andre immune eller inflammatoriske-medieret sygdomme, metoder til deres effektive generation og stabil vedligeholdelse er endnu ikke blevet udviklet. Da kun 1-5% af cirkulerende humane T-celler er tregs, kontrolleret ekspansion og differentiering overvinder denne mangel som en stor afskrækkende for gennemførelsen af tregs ind på klinikken. På den anden side, som vi lærte fra TGN1412 forsøget…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
- Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
- Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
- Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
- Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
- Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
- Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
- McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
- Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
- Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
- Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
- Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).
