Generering av Utførte regulatoriske T-celler fra primære humane naiv og Minne T-celler
Summary
Vi beskriver en metode for generering av regulatoriske, minne og naive T-celler fra et enkelt menneske blodgiver. Polarisert Tregs kan deretter sammenlignes med andre undergrupper i en rekke genetiske og funksjonelle applikasjoner med genetisk homogenitet, inkludert en undertrykkelse analysen også beskrevet her.
Abstract
Utvikling og vedlikehold av immunsuppressive CD4 + regulatoriske T-celler (Tregs) bidra til perifer toleranse for å forbli i immunologisk homeostase med den enorme mengden av selvtillit og Commensal antigener i og på menneskekroppen. Forstyrrelsene i balansen mellom Tregs og inflammatoriske konvensjonelle T-celler kan resultere i immunopathology eller kreft. Selv om terapeutisk injeksjon av Tregs har vist seg å være effektiv i murine modeller av en kolitt, type I 2 diabetes, revmatoid artritt og graft versus host sykdom, 4 flere grunnleggende forskjeller i menneskelige versus mus Treg biologi 5 har hittil utelukket klinisk bruk. Mangelen på tilstrekkelig antall, renhet, stabilitet og homing spesifisitet av terapeutisk Tregs nødvendiggjorde en dynamisk plattform for menneskelig Treg utvikling som å optimalisere forholdene for sin ex vivo ekspansjon 6.
Her har vi describe en metode for differensiering av indusert Tregs (iTregs) fra et enkelt menneske perifert blod donor som kan brytes ned i fire stadier: isolasjon av perifere mononukleære blodceller, magnetisk utvalg av CD4 + T celler, in vitro cellekultur og fluorescens aktivert celle sortering (FACS) av T-celle undergrupper. Siden Treg signaturen transkripsjonsfaktor forkhead boksen P3 (FoxP3) er en aktivering-indusert transkripsjonsfaktor i mennesker 7 og ingen andre unike markør eksisterer en kombinatorisk panel av markører må brukes til å identifisere T-celler med suppressor aktivitet. Etter seks dager i kultur, kan celler i systemet vårt skal avgrenses til naive T-celler, minne T-celler eller iTregs basert på deres relative uttrykk for CD25 og CD45RA. Som minne og naive T-celler har forskjellige rapporterte polarisering krav og plasticities 8, pre-sortering av den første T-celle befolkningen inn CD45RA + og CD45RO + undergrupper kan be brukes til å undersøke disse avvikene. Konsistent med andre, vår CD25 Hi CD45RA – iTregs uttrykte høye nivåer av FoxP3 9, GITR og CTLA-4 11 og lave nivåer av CD127 12. Etter FACS av hver populasjon, kan resulterende celler brukes i en Lyddemper analysen som evaluerer den relative evnen til å forsinke spredning av carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-merket autolog T-celler.
Protocol
Discussion
Mens Treg overføring holder enorm terapeutisk løftet i kampen mot autoimmunitet pode avvisning og andre immun eller provoserende-mediert lidelser, metoder for deres effektiv produksjon og stabil vedlikehold ennå ikke er utviklet. Som bare 1-5% av sirkulerende menneskelige T-celler er Tregs, overvinner deres kontrollert ekspansjon og differensiering dette sparsomt som en stor avskrekkende for gjennomføringen av Tregs inn i klinikken. På den annen side, så vi lært fra TGN1412 rettssaken 13, er det vitens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
- Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
- Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
- Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
- Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
- Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
- Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
- McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
- Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
- Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
- Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
- Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).
