1. Содержание животных и акклиматизации процедур Мужской и женский CD-1 мышей размещены с однополыми однопометников, до 5 животных на клетку, в стандартных пластиковых клетках, содержащих бета постельные принадлежности чип и nestlet колодки, с крышкой проволочной сетки для размещения бутылок с водой и пищей. Стандартная мышь корма и воды можно вволю в домашних клетках на протяжении всего эксперимента. Мыши ведутся на обратный свет-темнота график (свет с 22:00 до 10:00). Мыши могут акклиматизироваться в номерах IVSA тестирования в течение одной недели до начала экспериментальных процедур. 2. Оперантного обучения Все поведенческие процедуры, включая подслащенную подготовки молока и внутривенных наркотиков самоуправления сессий проводятся с использованием оперантного камер измерения 15,9 х 14 х 12,7 см, оснащен 2 сверхчувствительных мышью рычаги, ковш чашки, стимул огни и микролитр шприцевые насосы (Med ассоТочные Inc, Сент-Олбанс, VT, USA). Палаты сопряжены с компьютером с помощью смарт-Med Associates CR интерфейс и Med-программного обеспечения ПК для программирования графика арматуры и сбора данных. Наивные мышей приучали к оперантного камер и обучены, чтобы рычаг пресс использование подслащенного молока вознаграждение (0,1 мл), представленные в Ковш чашку. Оперантного обучения молока ведется в 1-часовой сессии в течение 5-7 дней. Завершение фиксированное соотношение (FR) план по активным рычагом привело к представлению чашку обозрения и освещения световой раздражитель. Подслащенного молока решение состояло из сахарозы (10 мг / мл, ACS реагент, Sigma-Aldrich Инк St-Louis Миссури, США) добавлен в цельном молоке (3,25% жирности). Оперантного обучения с подслащенным молоком или раствор жидкого подкрепления еды общий метод, используемый для облегчения оперантного отвечать в 1,2 мышей. 3. Подготовка оборудования, которое будет использовано во время операции RequМРЭО оборудования – 20, 23 и 26 калибровочного иглы, мясорубки, 1 шприц куб.см, Tygon трубы, паяльник, гепарин, антибиотики и обезболивающее. Подготовка иглы для руководства введение катетера в яремную вену после бритья вниз на 20 иглы. Вал иглы побрился вниз с помощью мясорубки, чтобы сформировать канал в игле, чтобы вести катетер трубки в вену. Иглу канала должны быть тщательно проверены для любых металлических обломков, которые могут быть сданы на хранение. Любые препятствия на канал должны быть очищены с помощью тонкой наконечником щипцы. Адаптация две 1-мл шприц, который будет использоваться для промывки и проверки катетер. Подготовьте два шприца, принимая 12 см куски Tygon трубы и прикрепить их на одном конце до 26 калибровочных иглы прикреплен к 1 шприцы куб.см, и растяжения других концах трубы более чем на 23 иглы калибра. Один шприц должны быть заполнены 0,9% стерильный физиологический раствор, а другая с гепарином решение тикарциллин (33 мг тикарциллини 0,3 мг гепарина в 10 мл стерильного физиологического раствора). Подготовка катетера канюлю колпачки. Tygon трубы растягивается в течение 23 иглу, и сократить 1 см от фаски. Растопить открытый конец трубки, чтобы создать толстую уплотнения. Трубки должны быть расплавлен так что вся крышка канюли достаточно долго, чтобы соответствовать по катетер канюля, с герметичной достойный конец плотно на конце канюли. Заметим, что если крышка слишком долго, есть риск, что он будет согнута, а затем пронзили в процессе крепления винта-на катетер крышки. Таким образом, тщательная подготовка катетер крышки рекомендуется для того, чтобы обеспечить хорошую подгонку к канюлю. Подготовьте необходимые решения. Все реагенты закупаются у Sigma-Aldrich Inc (Сент-Луис Миссури, США). Гепаринизированную решение тикарциллин для промывки катетера – Растворить 0,33 г тикарциллин (динатриевая соль) и 0,003 г гепарина в 10 мл стерильного физиологического раствора. 0,03 мл раствора вспыхнул Четух катетера ежедневно. Раствор антибиотика вводят для предотвращения образования тромбов и инфекций из развивающихся. Amikicin (антибиотик) для подкожных инъекций – одна подкожная инъекция дается после операции в дозе 10 мг / кг для предотвращения послеоперационных инфекций. Кетопрофен (анальгетик) для подкожных инъекций – одна подкожная инъекция дается после операции в дозе 5 мг / кг для управления любым послеоперационной боли. 4. Операция имплантации катетера Необходимое оборудование и реактивы: Isoflurane, стерильный физиологический раствор, спирт (70%), 1 и 3 шприца куб заполнен стерильным физиологическим раствором, 1-см адаптированы шприцы, антибиотики и обезболивающие растворы, приготовленные в разделе 3 выше, мышь катетеры (CamCaths, графство Кембриджшир, Великобритания ), катетер крышки (колпачки из кристаллов HRS научный, Монреаль, Квебек), глазные смазки, 4 см, пластиковые панели, чтобы поднять вены (этоможет быть построен из пластиковых Q-наконечник), Полиспорин, стерильные тампоны и марлю, изогнутые и прямые щипцы, зажимы артерии, декоративные ножницы. Использование стандартных асептических методов хирургического скамейке, хирургические инструменты, катетеры и стерилизуют до операции. Собственные методы стерилизации включают паровой стерилизации в автоклаве для хирургических инструментов и катетеров приобрести CamCaths. Стеклянный шарик стерилизация также может быть использован на кончиках хирургических инструментов. Стерилизации этилен оксидом могут быть использованы на более тонкий катетер или материалы, которые риском плавления. Более подробное описание грызунов хирургической асептики можно найти в прилагаемой 1,2 ссылками. Установите на скамейке, инструменты и носовой обтекатель для поддержания анестезии показано на фото. Мыши наркозом изофлураном газа, и поддерживать под анестезией с использованием дыхательной трубки под очистку системы. Глаз смазки (Слезы Naturale PM) наносится на оба глаза, чтобы предотвратить их от высыхания во время процедуры. Соответствующие хирургические маржа побрился на спину животного и на шее. Перед надрезов, хирургического поля ограничены использованием стерильными пеленками. В целях подготовки катетер для введения в правое предсердие сердца, избыточный трубопровод катетера отрезать 1,2 см от лампы из катетера. Это оптимальная длина, установленные для взрослых CD-1 мышей, примерно 8-недельного возраста, 20-25 граммов веса тела. Длина трубки катетера, возможно, должны быть скорректированы незначительно (методом проб и ошибок), на основе штамма, размер и возраст мышей. До вставки, шприц, содержащий стерильный физиологический раствор (раздел 3.2) крепится к катетера канюлю, и катетер промывают и проверены на герметичность. Держатьэто шприц прилагается к катетеру всей хирургической процедуры. Он будет использоваться для промывки катетера, и отступать крови в шаге 4.7. После стерилизации с 70% спиртом, 2 см длиной midscapular надрез, начиная посередине на спине и заканчивая чуть ниже шеи для того, чтобы разместить базу катетер. Соединительная ткань должна быть принудительной, кроме щипцами, чтобы освободить место для катетера базу под кожей. Размещение животных на спине, второй мелкий 1 – 2 см по диагонали разрез с правой ключицы, идущие вверх в челюсть животных, после того, как этот район был протереть 70% спиртом. Яремной вены будут найдены поверхностно под кожей шеи. В рамках подготовки введения катетера, трубки с базы катетер извлекается через разрез на спине и максимально приближены к яремной вены, передавая трубку под кожу прямо над правым плечом. В конце катетера, трубказатем присоединяются к артерии зажим и помещены в сторону животного, чтобы держать его на месте. Право яремной вены находится, мягко отходят поверхностные соединительной и жировой ткани с разрезом вокруг шеи животного. Соединительная ткань вокруг вены разрываются использованием изогнутых щипцов и вены, затем возведен используя стерильные пластиковые панели. Свободные открытые узлы шва производится около каждого конца вены и катетера трубы с резьбой через верхний узел и петлю над швом нить, чтобы отдохнуть Unclamped через правое плечо. До вставки, мокрой и 20 калибра иглы и вены стерильным физиологическим раствором для уменьшения трения. Игла проводится параллельно вене, и вставил аккуратно в нижней части повышенных вены (Примечание: около 0,5 см от кончика иглы необходимо войти в вену). Используя щипцы, сдвиньте катетер труб в шахту иглы в вену. Сопротивление будет означать, что я трубкуы в соединительной ткани, а не в вену. Нажмите 0,03 мл физиологического раствора через вену, чтобы убедиться, что нет никаких утечек. Утечки будет означать, что вены могут быть пробиты или что трубки катетера необходимо отрегулировать. Примечание: Чтобы проверить, если трубка находится в вене, пытаться составить некоторое крови с помощью прилагаемого солевой шприц. Если кровь не может быть немедленно составлен, вены или сердечной стенки могут быть закупорки катетера или вены не пронзил; настроить трубку и попробуйте еще раз. Иглы реинтеграции может быть необходимо, если кровь еще не может быть обращено вверх. В целях обеспечения катетер на месте, нажмите катетер лампу к точке вставки и удаления игл. Свяжите нижнюю узел и затем вытащить катетер вплотную баре, прежде чем связывать второй справа узел над лампочкой. Проверьте еще раз, чтобы увидеть, если кровь может быть составлен и ослабить узлы немного, если нужно. Подверните катетер трубки под кожей и шовныйвентральный вырез на шее животного. Применить Polysporin исцеление быстро, используя стерильный аппликатор хлопок, или любой другой антибиотик мазь предпочтительно содержащий некоторое обезболивающее в закрытом разрез. С животными на ее живот, поместить катетер базу под кожу спины в подготовленную разрез. Убедитесь в том, что избыток труб минимально петлю и хорошо скрыты под катетер базу, чтобы минимизировать шансы на животных жевания и пронзая его. Шовный разрез с обеих сторон катетера базу, и применить Polysporin быстрого исцеления с помощью стерильной аппликатор хлопка. Промойте катетер с 0,03 мл гепаринизированной решение тикарциллин с помощью шприца с трубкой прикрепленной к нему (раздел 3.2). Закройте канюля с пластиковой крышкой канюли и винт на крышке белого катетер. В некоторых мышей, которые являются свежими после операции, кровь может вытечь из катетера до канюли ограничен. Важно, чтобы повторно промыть животных и rapidlУ наденьте на него колпачок канюли до крови имеет возможность вытекать. Животные должны быть сброшены на ежедневной основе для поддержания катетера. После протирки инъекции области между животными задние ноги с 70% этанола, подкожно вводят обезболивающее кетопрофена в дозе 5 мг / кг, с одной стороны, и антибиотик amikicin в дозе 10 мг / кг на другую сторону. После анестезии прекращено, животных разрешено восстановить в чистую клетку с легким доступом к пище и воде в течение 5 до 7 дней. Мыши должны быть размещены в отапливаемом шкафу в течение ночи, чтобы предотвратить послеоперационные гипотермии. 5. Поведенческие испытания – внутривенное самоуправления До поведенческого тестирования катетеры промыть 0,9% стерильного физиологического раствора. Мыши затем поместитед в оперантного камеры и подключается к инфузии линий и инфузионные насосы. Активный прессы рычага в результате 3,2 сек 18 мкл инфузии препарата в сочетании с освещением световой раздражитель. Каждое нажатие рычага следуют 8 секунд тайм-аут, в течение которого световой раздражитель остается. После оперантного сессии, мышей катетеры промыть гепарином решение тикарциллин, прежде чем вернулся в свою родную клетку. Мыши имеют право самостоятельно управлять в течение 3 последовательных 2-ч сессий в каждой дозе. Дозы были представлены в случайном порядке для каждой мыши, как показано в следующем разделе. Катетера оценивается ежедневно, гарантируя, что как физиологический раствор и раствор антибиотика могут быть сброшены через катетер. Кроме того, кетамин / мидазолама испытание может проводиться, как описано в прилагаемой ссылке 5. Короче говоря, признаки анестезии, таких как неподвижность в течение 5 секунд вливания 0,02-0,03 мл кетамина (15 мг / мл),или мидазолам (0,75 мг / мл), мидазолам свидетельствует патент катетер 5.