该协议被成功地用于定量检测水平和mRNA表达的空间格局,在跨多个组织的脊椎动物物种类型。该方法可以检测低丰度的成绩单,并允许数以百计的幻灯片,同时处理。我们目前使用的禽流感为例,胚胎的大脑形成的表达分析这个协议。
认识的时间,水平,细胞定位,一个基因表达的细胞类型,有助于我们了解基因的功能。这些功能都可以在原位杂交基因在细胞内完成。在这里,我们提出修改克莱顿等人 (1988)已成功地在实验室多年,特别是成年脊椎动物的大脑2-5 原位杂交方法的放射性。长互补的RNA(cRNA的)探针的靶序列,可以检测低丰度转录6,7。纳入到cRNA探针的放射性核苷酸允许进一步的检测灵敏度低丰度转录和定量分析,无论是由光敏感的X光片或乳液涂在组织。这些检测方法提供了一个长期的记录靶基因的表达。与非放射性探针冰毒消耗臭氧层物质,如地高辛标记的放射性探针杂交方法不需要使用的HRP-抗体和/或TSA试剂盒检测低丰度转录的多个扩增步骤。因此,这种方法提供了一个定量分析的信号强度和有针对性的表达量之间的线性关系。它可以同时处理100-200幻灯片。它的工作原理以及不同发育阶段的胚胎。最发育的基因表达研究使用整个胚胎和非放射性的方法,在8,9部分,是因为胚胎组织比成人组织更脆弱,减少细胞间的凝聚力,使组织切片的细胞群之间的界限很难看到。相比之下,我们的放射性的方法,由于更大范围的灵敏度,是组织地区之间的基因表达的决议能够得到更高的对比度,使其更容易看到种群之间的界限。使用这种方法,研究人员可以揭示一种新发现的基因可能的意义,并进一步预测感兴趣的基因的功能。
放射性原位杂交mRNA表达被广泛用于多种用途,包括研究区域组织的组织,细胞类型和脑功能活动2-5,10,12-14。以后使用,其大脑中的mRNA表达是依赖于神经活动增加,活动相关的基因通常被称为即早基因的基因。与这些用途中,我们的方法已被应用于多个物种,包括鸟类,哺乳类动物(如人类),鱼类,两栖类动物;在多个组织,包括脑,皮肤,肌肉和多个年龄段,包括幼体/新生儿,青少年,成人,并在整个胚胎部分2,3,5,15-17。我们的协议的特殊功能包括:(1)产生一个解剖特异性和特异性定量之间的平衡。量化基因表达的X射线胶片上,我们采取的数码照片的图像(如: 图1A和1B),使用“保护海港条例”toshop(;)直方图功能,在该地区的利益来衡量的像素密度和减去组织以外的胶片上的背景水平,但仍然在载玻片上2,4。为了量化在细胞水平上的表达,我们采取了图像的银粒细胞在高倍率下(40-100X, 图4)。然后,我们使用图像J的阈值和测量功能,在美国国立卫生研究院韦恩Rasband来计算图像中的银颗粒的数量,而不在载玻片上的细胞在类似的区域减去背景计数,分化的细胞数量,获得每个细胞中的表达。4,18 A值(2)它可以是相对较高的吞吐量,允许100-200幻灯片同时处理,由于紧张的盖玻片密封矿物油浴。标准的原位杂交方法需要较长的时间密封幻灯片封口膜,指甲油,和其他手段,幻灯片占用了大量的空间;(3)它是高度的敏感的低丰度的成绩单,由于硫酸葡聚糖和登哈特的杂交缓冲2,13的解决方案;(4)在暗视野成像的方法产生高对比度的图像,由于在解剖显微镜4,5暗场照明下图片。此外,它可以让敏感的微小变化,如在活动依赖的基因表达,基因表达的检测,以确定特定的大脑激活区域的19个具体行为的感知和生产过程中。相对非放射性协议的限制,后者是在蜂窝决议和细胞内的基因的位置清晰,并与乳液的工作是非常敏感的操纵和光。这是可能的,结合我们的方法与其他方法,如非放射性原位杂交标记mRNA表达多个基因在同一组织10,17,20。它可以结合免疫细胞化学标注上相同的样品RNA和蛋白表达,以合作,本地化与某些类型的细胞的基因10。这种双标记实验所需的协议修改描述中引用的参考文献。
总之,我们的做法有利于细胞的基因表达的时间和位置的认识,以便了解区域组织,组织功能活动,和基因功能。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢所有的贾维斯实验室成员多年来的改进协议。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetic anhydride | VWR | MK242002 | |
Chloroform | VWR | BDH1109 | |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
Cryostat | Thermo scientific | Microm HM550 | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | |
DTT | Promega | P1171 | 100mM |
EDTA | Sigma | ED | |
Embedding mold | VWR | 15160-215 | |
Fisher brand Superfrost plus slide | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | |
Formamide | Sigma | F7508 | |
GENECLEAN kit | Q-Bio gene | 1001-200 | |
Kodak BioMax MR film | Sigma | Z350370 | |
Kodak NTB Emulsion | Carestream Health | 8895666 | |
Kodak Professional developer D19 | Kodak | 1462593 | |
Kodak professional Fixer | Kodak | 1971746 | |
β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
Mineral oil | VWR | IC15169491 | |
NaOH | VWR | SX0600-1 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | |
Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | |
rATP | Promega | P1132 | 10mM |
rCTP | Promega | P1142 | 10mM |
rGTP | Promega | P1152 | 10mM |
RNasin | Promega | N2111 | 40Units/μl |
S35 UTP | PerkinElmer | NEG039C001MC | |
Safety-Solve solution | Safety Solve Research Products International | 111177 | |
Sodium Acetate | Sigma | S7899 | 3M |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
SP6 RNA polymerase | Promega | P1085 | |
Staining metal rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
T7 RNA polymerase | Promega | P2075 | |
Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
5x Transcription buffer | Promega | P1181 | |
Triethanolamine | VWR | IC15216391 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | VWR | 101449-446 | |
tRNA | Roche | 10109509001 |
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