ويستخدم بنجاح هذا البروتوكول للكشف عن كميا المستويات والأنماط المكانية التعبير مرنا في أنواع الأنسجة متعددة عبر أنواع الفقاريات. يمكن للطريقة الكشف عن النصوص وفرة منخفضة، وتتيح معالجة مئات من الشرائح في وقت واحد. نقدم هذا البروتوكول باستخدام التنميط التعبير عن الطيور تشكيل المخ الجنينية كمثال على ذلك.
معرفة توقيت، مستوى، توطين الخلوية، ونوع من الخلايا التي يتم التعبير عن الجينات في يساهم في فهمنا للعمل الجين. ويمكن تحقيق كل هذه الميزات مع التهجين في الموقع لmRNAs داخل الخلايا. هنا نقدم مشعة في طريقة التهجين في الموقع معدلة من كلايتون وآخرون (1988) (1) التي كانت تعمل بنجاح في المختبر لسنوات عديدة، وخاصة بالنسبة للأدمغة الفقاريات الكبار 2-5. منذ فترة طويلة تكميلية الحمض النووي الريبي (كرنا) تحقيقات للتسلسل الذي يسمح للكشف عن الهدف من وفرة النصوص منخفض 6،7. إدماج النيوكليوتيدات المشعة في تحقيقات كرنا يسمح لحساسية الكشف عن مزيد من المحاضر وفرة منخفضة، والتحليل الكمي، إما عن طريق ضوء فيلم الأشعة السينية الحساسة أو مستحلب المغلفة على الأنسجة. هذه طرق الكشف توفير سجل طويل الأمد من التعبير الجيني الهدف. مقارنة مع المنهجيات مسبار غير المشعةالمواد المستنفدة للأوزون، مثل مجموعة دبي للاستثمار ووضع العلامات، وتهجين مسبار المشعة الأسلوب لا يتطلب خطوات التضخيم متعددة باستخدام HRP-الأجسام المضادة و / أو عدة TSA للكشف عن النصوص وفرة منخفضة. لذلك، وهذه الطريقة توفر وجود علاقة خطية بين كثافة إشارة والمبالغ المستهدفة مرنا للتحليل الكمي. لأنها تتيح معالجة 100-200 الشرائح في وقت واحد. كان يعمل بشكل جيد لمراحل النمو المختلفة للأجنة. معظم الدراسات التنموية في التعبير الجيني استخدام الأجنة كلها والنهج غير المشعة 8،9، وذلك جزئيا بسبب الأنسجة الجنينية هي أكثر هشاشة من أنسجة البالغين، مع أقل التماسك بين الخلايا، مما يجعل من الصعب معرفة الحدود الفاصلة بين سكان الخلية مع المقاطع النسيجية. في المقابل، نهجنا المشعة، ونظرا لنطاق أكبر من الحساسية، غير قادرة على الحصول على أعلى تباين في القرار في التعبير الجيني بين المناطق الأنسجة، مما يجعل من الاسهل لمعرفة الحدود الفاصلة بين السكان. باستخدام هذه الطريقة، يمكن للباحثين الكشف عنأهمية ممكن من الجينات التي تم تشخيصها حديثا، وتوقع مزيد من وظائف الجينات في المصالح.
ويستخدم على نطاق واسع المشعة في التهجين الموضعي التعبير مرنا لأغراض متعددة، بما في ذلك لدراسة منظمة إقليمية للنسيج، أنواع الخلايا، ونشاط المخ وظيفية 2-5،10،12-14. لاستخدامها لاحقا على الجينات التي مرنا التعبير في الدماغ تعتمد على زيادة النشاط العصبي، وغالبا ما تسمى الجينات التي تعتمد على نشاط أو الجينات في وقت مبكر على الفور. مع هذه الاستخدامات، وقد تم تطبيق أسلوب لدينا عبر أنواع متعددة، بما في ذلك الطيور والثدييات (مثل الإنسان)، والأسماك، والبرمائيات، في أنسجة متعددة، بما في ذلك الدماغ والجلد والعضلات، والذين تتراوح أعمارهم متعددة، بما في ذلك السلاحف / حديثي الولادة، والأحداث والبالغين، وهنا في الفروع جنين كامل 2،3،5،15-17. السمات الخاصة للبروتوكول لدينا ما يلي: (1) وتنتج توازنا بين خصوصية التشريحية والتحديد الكمي. لقياس التعبير الجيني في فيلم الأشعة السينية، ونحن نأخذ الصور الرقمية من الصور (مثلا:. الشكل 1A و 1B)، استخدم فوtoshop وظيفة الرسم البياني (أدوبي) لقياس كثافة بكسل في مناطق الاهتمام وطرح مستويات أساسية عن فيلم خارج من النسيج ولكن لا يزال على شريحة زجاجية 2،4. لقياس التعبير على المستوى الخلوي، ونحن نأخذ صورا من الحبوب الفضة أكثر من الخلايا تحت التكبير عالية (40 100X؛ الشكل 4). نحن بعد ذلك استخدام عتبة ووظائف مقياس J صورة بواسطة Rasband وين في المعاهد الوطنية للصحة لحساب عدد من الحبوب الفضية في الصورة، وطرح عدد من خلفية في منطقة مماثلة من دون الخلايا على شريحة زجاجية، تقسيم من قبل عدد من الخلايا، للحصول على القيم والتعبير في كل خلية. 4،18 (2) ويمكن أن يكون إنتاجية عالية نسبيا، مما يسمح للتجهيز 100-200 الشرائح في وقت واحد، ونظرا لضيق ختم ساترة التي أنشأتها المعدنية حمام الزيت. معيار طرق التهجين في الموضع يستغرق وقتا أطول لختم الشرائح مع parafilm، طلاء الأظافر، وغيرها من الوسائل، حيث الشرائح يستغرق الكثير من الفضاء، (3) وهي عاليةالحساسة من النصوص وفرة منخفضة نظرا لكبريتات ديكستران وحل دينهارت في المنطقة العازلة تهجين 2،13، (4) ونهج التصوير في الساحة المظلمة يعطي صورا عالية على النقيض من ذلك بسبب التقاط الصور تحت إضاءة الساحة المظلمة على مجهر تشريح 4،5. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح كشف حساسة للتغيرات الصغيرة في التعبير الجيني، مثل في التعبير الجيني التي تعتمد على نشاط لتحديد مناطق محددة في الدماغ تنشط أثناء الإدراك وإنتاج سلوكيات معينة 19. القيود بالنسبة لغير المشعة البروتوكولات هي أن هذا الأخير أكثر وضوحا في القرار الخلوية وموقع مرنا داخل الخلية، والعمل مع مستحلب حساس جدا للتلاعب والضوء. ومن الممكن الجمع بين أسلوب لدينا مع وسائل أخرى، مثل مشعة غير تهجين موضعية لتسمية التعبير مرنا أكثر من جين واحد في نفس النسيج 10،17،20. ويمكن دمجها مع كيمياء سيتولوجية مناعيةلتسمية كل من الحمض النووي الريبي والتعبير بروتين على نفس العينة من أجل المشاركة في توطين ومرنا مع بعض أنواع الخلايا 10. وصفت التعديلات اللازمة لبروتوكول هذه التجارب وضع العلامات المزدوجة في المراجع المشار إليها.
وخلاصة القول، نهجنا يسهل فهم توقيت ومكان الخلوية في التعبير الجيني من أجل فهم تنظيم المنطقة، ونشاط الأنسجة وظيفية، وظيفة الجين.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء مختبر جارفيس الذي تحسنت البروتوكول على مر السنين.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetic anhydride | VWR | MK242002 | |
Chloroform | VWR | BDH1109 | |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
Cryostat | Thermo scientific | Microm HM550 | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | |
DTT | Promega | P1171 | 100mM |
EDTA | Sigma | ED | |
Embedding mold | VWR | 15160-215 | |
Fisher brand Superfrost plus slide | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | |
Formamide | Sigma | F7508 | |
GENECLEAN kit | Q-Bio gene | 1001-200 | |
Kodak BioMax MR film | Sigma | Z350370 | |
Kodak NTB Emulsion | Carestream Health | 8895666 | |
Kodak Professional developer D19 | Kodak | 1462593 | |
Kodak professional Fixer | Kodak | 1971746 | |
β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
Mineral oil | VWR | IC15169491 | |
NaOH | VWR | SX0600-1 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | |
Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | |
rATP | Promega | P1132 | 10mM |
rCTP | Promega | P1142 | 10mM |
rGTP | Promega | P1152 | 10mM |
RNasin | Promega | N2111 | 40Units/μl |
S35 UTP | PerkinElmer | NEG039C001MC | |
Safety-Solve solution | Safety Solve Research Products International | 111177 | |
Sodium Acetate | Sigma | S7899 | 3M |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
SP6 RNA polymerase | Promega | P1085 | |
Staining metal rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
T7 RNA polymerase | Promega | P2075 | |
Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
5x Transcription buffer | Promega | P1181 | |
Triethanolamine | VWR | IC15216391 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | VWR | 101449-446 | |
tRNA | Roche | 10109509001 |
Solutions: