रेडियोधर्मी बगल में ऊतक में विविध जीन एक्सप्रेशन पैटर्न का पता लगाने के लिए संकरण

Summary

इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक करने के लिए मात्रात्मक हड्डीवाला प्रजातियों भर में कई प्रकार के ऊतकों में और स्तर mRNA अभिव्यक्ति के स्थानिक पैटर्न का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. विधि कम बहुतायत टेप का पता लगाने और एक साथ स्लाइड्स के सैकड़ों के प्रसंस्करण की अनुमति देता है. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक उदाहरण के रूप में एवियन भ्रूण मस्तिष्क के गठन की अभिव्यक्ति की रूपरेखा प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)¹ that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains^2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts^6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches^8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Protocol

1. ऊतक तैयार ताजा ऊतकों फसल. एवियन भ्रूण के लिए, ध्यान से अंडे को खोलने के लिए और 1xPBS, दो बार के साथ एक थाली में भ्रूण साफ. वयस्क दिमाग के लिए, जल्दी से मस्तिष्क को हटा दें और धीरे x 1 पीबीएस के साथ धो. भ्रूण या वयस्क मस्तिष्क एक एम्बेडेड अक्टूबर ऊतक टेक की पूर्ण मोल्ड में एम्बेड करने के लिए, ऊतक orientating के रूप में प्रोटोकॉल के लिए की जरूरत है, और जल्दी से यह एक और इथेनॉल शुष्क बर्फ मिश्रण में डाल, सावधान किया जा रहा करने के लिए ब्लॉक के अंदर मिश्रण नहीं मिल ब्लॉक स्थिर . Cryostat में 10-12 माइक्रोन मोटी वर्गों में जमी नमूना टुकड़ा. मस्तिष्क और भ्रूण ऊतक के लिए, सबसे अच्छा काटने शीतोष्ण -20 डिग्री सेल्सियस -18 डिग्री सेल्सियस की सीमा के भीतर है सुपर प्लस गिलास स्लाइड पर जमे हुए वर्गों माउंट. -80 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड बॉक्स में वर्गों की दुकान 2. रेडियोधर्मी Riboprobes पीढ़ी (अपनी संस्था के विकिरण सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें) एक शुद्ध रैखिक डी.एन. उत्पन्नएक क्लोन प्लास्मिड डीएनए या शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर बाध्यकारी साइटों से जुड़ी डालने की पीसीआर द्वारा शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर साइटों से घिरा हुआ टुकड़ा प्रतिबंधित पचाने के एंजाइम द्वारा या तो ब्याज की सीडीएनए की एक टेम्पलेट. यह भी संभव है 3 'और 5' पीसीआर प्राइमरों के भाग के रूप में शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटरों के साथ पीसीआर टुकड़े उत्पन्न. जैल GENECLEAN जेल शुद्धि किट के साथ अपने प्रतिबंधित या पीसीआर उत्पन्न टुकड़े शुद्ध. 0.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब, शुद्ध रैखिक डीएनए टेम्पलेट की 0.5-1 μg, प्रतिलेखन बफर, डीटीटी, RNasin AGC nucleotide के मिश्रण समाधान, और RNase मुक्त पानी जोड़ने के लिए वांछित राशि की मात्रा लाने. तब 35-UTP एस और उचित शाही सेना पोलीमरेज़ जोड़ने के लिए या तो antisense या भावना riboprobes के. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1 घंटे के लिए मिश्रण को सेते हैं. शाही सेना पोलीमरेज़ की एक और अशेष भाजक जोड़ें और एक और 1 घंटे के लिए सेते हैं. 3M सोडियम एसीटेट (कुल मात्रा का 0.1 गुना) समाधान और 100% EtOH (2.5 के लिए जोड़ेंकुल मात्रा का Eppendorf ट्यूब में) ld संश्लेषित आरएनए riboprobe के वेग के लिए. शुष्क बर्फ या -80 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट या अधिक से अधिक 3 घंटे के लिए तेज़ी की सहायता के लिए सेते हैं. गोली शाही सेना के 4 बजे centrifuging डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट के लिए एक टेबल टॉप Eppendorf अपकेंद्रित्र में 15,000 rpm. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 70% EtOH साथ गोली धोने, उंगली के साथ नल को गोली मिश्रण अच्छी तरह से. गोली फिर से शाही सेना के 4 बजे centrifuging डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट के लिए 15,000 rpm. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह pipeting द्वारा और निकालें तो 40 μl संकरण समाधान जोड़ने के. में और बाहर pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. जगमगाहट शीशी, अच्छी तरह से मिश्रण में 3 मिलीग्राम समाधान सुरक्षा समाधान में समाधान की एक μl रखो, और जगमगाहट काउंटर में गिना जाता है को मापने. एक सप्ताह के भीतर उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर riboprobe के साथ Eppendorf रखें. 3. ऊतक उपचार एक डाकू तैयार, ताजा पीबीएस 4% paraformaldehy के बफरके बारे में 3-5 ° कमरे के तापमान ऊपर सी डी समाधान. -80 से जगह स्लाइड डिग्री सेल्सियस भंडारण सूखी बर्फ पर एक धातु रैक में हुड के तहत अंतरिक्ष में काम करने के लिए ले जाने के लिए, और फिर 4% paraformaldehyde समाधान में रैक जगह है, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. 1 एक्स पीबीएस में प्रत्येक 15 (डुबकी प्रति 1 सेकंड के आसपास) गिरावट के बारे में 3 बार धो लें. हुड में, एसिटिलीकरण बफर बनाने के लिए और यह 10 सेकंड के भीतर सख्ती से हिला. तुरंत स्लाइड के रैक वाले ट्रे में डाल और 10 मिनट के लिए सेते हैं, riboprobe के बंधन पृष्ठभूमि को कम. 2 एक्स SSPE में 15 dips के लिए 3 बार कुल्ला. 70%, 95% और 100% प्रत्येक चरण में 2 मिनट के लिए EtOH धारावाहिक में निर्जलीकरण (हुड में होना जरूरी नहीं है). हुड के नीचे कम से कम 10-15 मिनट के लिए स्लाइड सूखी. 4. संकरण Riboprobe की राशि (6 स्लाइड प्रति 0.5 1×10 सीपीएम) और संकरण (स्लाइड प्रति 100 μl) सभी स्लाइड्स के लिए आवश्यक समाधान की गणना. Prewarm riboprobe – संकरण 65 मिश्रण डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए riboprobe denature. Pipet स्लाइड भर में एक पंक्ति में समाधान riboprobe के संकरण, और एक गिलास coverslip का उपयोग करने के लिए ऊतक और coverslip पर समान रूप से फैला के 100 μl. जगह क्षैतिज स्लाइड, एक धातु रैक और जगह रैक में ईमानदार 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तेल स्नान और 16 घंटे की एक अधिकतम में धीरे से सीधा सामना करना पड़ रहा है. तेल coverslips चारों ओर एक airtight मुहर बनाता है. धातु रैक तेल स्नान से निकालें और टिशू पेपर के साथ रैक के आसपास अतिरिक्त तेल पोंछे. बंद कवर स्लाइड और गिलास या धातु युक्त क्लोरोफॉर्म, दो बार ट्रे में धातु रैक से तेल धो लें. 2 एन डी क्लोरोफॉर्म धोने अगले प्रयोग के लिए पहले के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ट्रे में 0.1% में β mercaptoethanol 2 + एक्स SSPE के समाधान के साथ कवर स्लाइड के साथ रैक और हस्तांतरण और कदम नीचे कुछ dips के लिए coverslips ढीला और हटाने अतिरिक्त संकरण समाधान भंगtion. 0.1% β-mercaptoethanol 2 + SSPE एक्स के ताजा समाधान में शामिल स्लाइड के साथ रैक स्थानांतरण, और तब ऊतक वर्गों scratching के रोकने के समाधान में एक RNase मुक्त संदंश के साथ coverslips हटा. एक ट्रे क्षैतिज स्लाइड रैक धारक में ताजा रैक में खुला स्लाइड 2 एक्स SSPE में 0.1% β-mercaptoethanol के समाधान में, स्थानांतरण. ताजा 0.1% β-mercaptoethanol में स्लाइड के साथ रैक + 2 x 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर SSPE समाधान के लिए अतिरिक्त अपार शाही सेना जांच निकालें. सेते हैं इस और पिछले जलीय धोने समाधान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रेडियोधर्मी कचरे के रूप में coverslips, त्यागें. स्लाइड के साथ रैक में 65 prewarmed 2x SSPE समाधान डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरण करने के लिए, 0.1% की एकाग्रता की एक अंतिम β-mercaptoethanol जोड़ने के, और 1 घंटे के लिए 65 ° सी में सेते हैं. रेडियोधर्मी कचरे के रूप में त्यागें. स्थानांतरण और 30 मिनट प्रत्येक के लिए 65 में दो बार prewarmed 0.1 एक्स SPPE में स्लाइड के साथ रैक डिग्री सेल्सियस सेते हैं. रेडियोधर्मिता की राशि में हटायह कदम बहुत छोटा है और अब इस कदम के बाद अत्यधिक रेडियोधर्मी कचरे माना जाता है. रैक और स्लाइड के 70% में, 95% और 2 मिनट प्रत्येक के लिए 100% EtOH निर्जलीकरण. कम से कम 30 मिनट के लिए हुड में स्लाइड सूखी. 5. रेडियोधर्मी सिग्नल की विज़ुअलाइज़ेशन एक फिल्म कैसेट में शुष्क स्लाइड प्लेस और एक अंधेरे कमरे में, स्लाइड पर एक्स – रे फिल्म (कोडक Biomax एमआर फिल्म) जगह है, और कैसेट को बंद करें. सुनिश्चित करें कि स्लाइड एक्स – रे की फिल्म पायस पक्ष का सामना कर रहे हैं. ~ 1-7 टेप की उम्मीद बहुतायत के आधार पर दिनों के लिए स्लाइड बेनकाब. मानक डेवलपर और फिक्सर में एक्स – रे फिल्म का विकास करना. संकरण संकेत फिल्म पर काले (पायस में चांदी अनाज उजागर) छवि (1) के रूप में दिखाता है. (वैकल्पिक) सेलुलर संकल्प को निर्धारित करने और ऊतक पर संकेत देखना, स्लाइड फोटो पायसन में डूबा हुआ जा और counterstained की जरूरत है.यदि आप अंततः cresyl बैंगनी साथ counterstain जा रहे हैं, तो xylene में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दो बार, 100%, 100%, 95%, 95%, 70%, और 50% EtOH में 1 मिनट प्रत्येक rehydrate incubating के द्वारा वर्गों delipidize और फिर विआयनीकृत पानी में. यदि आप एक डाई कि delipidization की आवश्यकता नहीं है के साथ में दाग नहीं जा रहे हैं, तो delipidization आवश्यक नहीं है. सूखी अच्छी तरह से कम से कम 2-3 घंटे के लिए हुड के नीचे स्लाइड. अंधेरे कमरे में एक सुरक्षित प्रकाश का उपयोग, पर्याप्त कोडक NTB पायस स्कूप करने के लिए 1/2 लंबाई कंटेनर कांच सूई में स्लाइड (यानी ऊतक) को कवर करने के लिए, और फिर 20-30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघला. तो यह 1:1 के अनुपात के लिए आसुत पानी के साथ जलमिश्रित. पायस का स्तर अब जब यह स्लाइड में डूबा हुआ है एक स्लाइड पर सभी वर्गों को कवर किया जाना चाहिए. यदि आप स्लाइड का एक बहुत कुछ है, तो आप अतिरिक्त पायस तैयार करने की आवश्यकता हो सकती है. ° overnig सी पानी स्नान और एक बंद प्रकाश तंग कंटेनर में शुष्क डूबा स्लाइड 42 में पतला पायस में डुबकी स्लाइडअंधेरे कमरे में, या 2-3 घंटे के लिए 37 ° सी में एक बंद रोशनी के साथ, ओवन में ht. रैक स्लॉट में स्लाइड desiccators युक्त काले बक्से में स्थानांतरण स्लाइड्स के लिए सावधान किया जा रहा है एक दूसरे को छू नहीं है और इस तरह कलाकृतियों बनाने. काले बिजली के टेप के साथ बक्से के किनारों को सील धीरे धीरे स्थिर प्रेरित प्रकाश स्पार्क्स को रोकने के लिए और फिर एल्यूमीनियम पन्नी में बक्से लपेटो. 4 में बक्से स्टोर डिग्री सेल्सियस कई दिनों से सप्ताह के लिए (एक्स – रे फिल्म पर 1 दिन से संकेत पायस के तहत 5 दिनों के लिए समान है). कमरे के तापमान 1 घंटे के लिए स्लाइड बक्से गर्म. Darkroom में, स्लाइड के साथ रैक हटा (या एक धातु रैक में जगह स्लाइड स्लाइड स्लॉट के साथ बक्से का उपयोग करके) और बक्से से उन्हें कोडक डी 19 डेवलपर में 3.5 मिनट के लिए 16 ° सी में विकसित. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पानी के नल में विकसित स्लाइड्स धो लें. स्लाइड फिक्सर में दो बार प्रत्येक 6 मिनट 19 ° C के लिए सेते हैं पर. रोशनी दूसरी फिक्सर ऊष्मायन के दौरान चालू किया जा सकता है. </li> कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पानी चलाने में स्लाइड्स धो और स्लाइड के पीछे की ओर से एक रेजर ब्लेड गिलास scratching के रोकने के साथ, जबकि गीला पायस परिमार्जन. 0.3% 5 मिनट के लिए पानी के नल में cresyl बैंगनी के साथ ऊतक दाग. ताजा पानी के नल में ~ 15 dips के लिए अतिरिक्त cresyl बैंगनी समाधान धो लें. 50%, 70%, 95%, 95%, 100% और 100% EtOH: ~ 15 प्रत्येक शराब समाधान में गिरावट के लिए स्लाइड निर्जलीकरण. Xylene में स्लाइड दो बार कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. यह कई दिनों लेने से पहले गोंद काफी मजबूत करने के लिए स्लाइड आगे साफ है, स्लाइड पर Permount मध्यम और सूखी रातोंरात (16 घंटा) हुड में स्लाइड कवर के साथ coverslip. 6. Darkfield रंग छवियाँ उत्पन्न यदि आवश्यक हो, आगे यह पानी के साथ गीला और एक धार के साथ scraping के द्वारा स्लाइड की (ऊतक बिना गैर coversliped ओर) पीठ पर साफ अतिरिक्त पायस. <li> 80% EtOH समाधान के साथ स्लाइड्स कुल्ला और धीरे 1-2 बार पोंछ मलबे और धूल से छुटकारा पाने के. Darkfield या brightfield रोशनी के तहत तस्वीरें ले लो. 6.2 और 6.3 कदम करने के लिए 2-3 बार दोहराया जा क्रम में धूल कण, जो आसानी से एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कर रहे हैं darkfield में देखा के बिना एक अच्छा छवियों को प्राप्त हो सकता है. 7. प्रतिनिधि परिणाम 1) एक्स – रे फिल्म है कि स्लाइड या 2 पर रखा गया था) पायस कि स्लाइड्स पर लेपित किया गया था: ऊतक एस 35 रेडियोधर्मी जांच के साथ संकरित वर्गों पर स्वस्थानी संकरण के परिणामों में देखने के दो मुख्य तरीके हैं. एक तीसरा दृष्टिकोण एक phosphorimager स्लाइड से अधिक रखा स्क्रीन का उपयोग कर रहा है, लेकिन हम इस दृष्टिकोण के संकल्प के साथ संतुष्ट नहीं है. एक्स – रे की फिल्मों को एक त्वरित परिणाम और संकरण की समग्र स्थिति का विश्लेषण प्रदान करते हैं. एक्स – रे फिल्म डेटा भी व्यापक संरचनात्मक संकल्प का पता चलता है और मात्रात्मक analys के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है10 है. देर एवियन भ्रूण FoxP1 और CoupTF2 जीन अभिव्यक्ति लिए antisense जांच के साथ संकरित सिर के एक्स – रे फिल्म छवियों का उदाहरण आंकड़े 1 ए और बी में हैं दोनों जीन अत्यधिक विशिष्ट मस्तिष्क सब्दिविजंस में प्रचुर मात्रा में हैं. एक अच्छी गुणवत्ता फिल्म एक्स – रे परिणाम तेज हो सकता है () धुँधली नहीं करना चाहिए और उच्च अनुपात संकेत करने के लिए पृष्ठभूमि है. एक धुंधला छवि फिल्म एक्स – रे और संकरित ऊतक के साथ गिलास स्लाइड के बीच असमान से संपर्क करने के लिए कारण हो सकता है. पायस डूबा स्लाइड्स के लिए, पायस प्रकाश के प्रति संवेदनशील चांदी ऊतक के रूप में एक्स – रे फिल्म की प्लास्टिक पर जा रहा करने के लिए apposed पर लेपित लवण होते हैं. के दौरान विकासशील, एस 35-उजागर चांदी लवण चांदी अनाज धातु एक्स – रे फिल्म में परिवर्तित कर रहे हैं बहुत पसंद है. हालांकि, चांदी जमा जीन अभिव्यक्ति है कि और एक खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है गुणात्मक मापा का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं पर सीधे दिखाई दे रहे हैं. धातु चांदी अनाज के माध्यम से प्रत्यक्ष प्रकाश ब्लॉकऔर brightfield देखने के तहत काले बिंदु के रूप में दिखाई देते हैं. cresyl बैंगनी counterstain बैंगनी रंग में प्रकट होता है (छवि 3A, 3C, और 4 चित्र.). , Darkfield में चांदी अनाज की ओर से आने वाले प्रकाश को प्रतिबिंबित और सफेद डॉट्स (छवि 1C, 1D, 3B और 3 डी) के रूप में दिखाई देते हैं. इस स्थिति में, cresyl बैंगनी दाग ​​लाल रंग में दिखाई देता है. Brightfield, संकरण संकेत करने के लिए आसान है सेलुलर संकल्प में उच्च वृद्धि के तहत देखने के लिए, जबकि darkfield में, इसके अलावा में, संकरण संकेत पूरे ऊतक पर कम बढ़ाई के अंतर्गत देखा जा सकता है. darkfield दृश्य दृष्टिकोण हम सामान्यतः समग्र जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को दिखाने का है. हालांकि, त्वरित परिणाम एक्स – रे की फिल्मों से प्राप्त करने के लिए रिश्तेदार, पायस डूबा स्लाइड अब समय लेता है (एक कई हफ्तों के लिए) और अधिक पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए संवेदनशील है. मजबूत पृष्ठभूमि की चार सामान्य स्रोत हैं: 1) एक्स – रे फिल्म पर सभी पृष्ठभूमि आमतौर पर करने के लिए करना हैडेवलपर या फिक्सर, या आंशिक रूप से उजागर फिल्म के साथ समस्याओं, गिलास स्लाइड पर 2) पृष्ठभूमि आमतौर पर है धोने या कांच के वाणिज्यिक स्रोत या स्वयं तैयार से स्लाइड्स की अनुचित silination के के रूप में स्लाइड तैयार करने, के साथ समस्याओं के कारण, 3) पायसन सावधान के बाद संकरण धोने के चरणों की कमी के कारण या तो अनुभाग, एक संकरण तापमान के बहुत कम, संकरण समाधान की खराब गुणवत्ता, बर्तन धोने में paraformaldehyde संदूषण के कारण जांच करने के लिए स्थायी रूप से पार लिंक पर पृष्ठभूमि और 4), जोखिम और विकास पृष्ठभूमि ऊतक, riboprobe, छोटे अणुओं ऊतक गैर – विशेष रूप से लेबलिंग, निष्क्रिय डीटीटी या β-mercaptoethanol एस के ऊतकों को जोड़ने di सल्फाइड बांड में 35 आरएनए जांच पार करने में जिसके परिणामस्वरूप, और एसिटिलीकरण के लिए भी लंबे समय से प्रतीक्षा करने के लिए अग्रणी गिरावट. यह के एसिटिक एनहाइड्राइड और triethanolamine के मिश्रण के सेकंड के भीतर एसिटिलीकरण समाधान में स्लाइड करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि कई मिनट withou गुजरती हैंस्लाइड करने के लिए समाधान जोड़ने, तो acetyl समूह को कुशलता से हटाया नहीं जाएगा और फिर गैर विशेष रूप से शाही सेना बाँध. अन्य कारकों को 20 घंटा से अधिक संकरण, जो भी एक संकेत के मजबूत उत्पन्न कर सकते हैं और स्लाइड है, जो जलीय washes के दौरान स्लाइड्स पर संकरण समाधान एकांत में रहना, ऊतक पर रेडियोधर्मी स्थानों में जिसके परिणामस्वरूप पर अतिरिक्त तेल बूंदों और अंधेरे पृष्ठभूमि का संकेत देने के स्लाइड. यदि कई स्लाइड्स (100 से अधिक स्लाइसें) के साथ काम जोड़ने के लिए, 3 Rd क्लोरोफॉर्म धोने या क्लोरोफॉर्म washes बदलने के लिए, स्लाइड पर शेष से अतिरिक्त तेल कणों को रोकने. लापरवाह इलाज ऊतक, यानी ठंड (विच्छेदन बाद 5-10 मिनट के भीतर) जल्दी से पर्याप्त नहीं या विगलन और फिर से ठंड भी पृष्ठभूमि mRNA गिरावट के कारण बढ़ जाती है. पृष्ठभूमि के ऊपर प्रदर्शन के लिए गलती नहीं करने के लिए सावधान रहें. डूबा स्लाइड पर पायस पृष्ठभूमि के लिए संभव है क्योंकि यह बेहद संवेदनशील प्रकाश और अंधेरे में लंबे समय से जोखिम की आवश्यकता है. कॉम सोम पृष्ठभूमि समस्याओं डेवलपर और फिक्सर के लिए तापमान के उच्च भी शामिल हैं. जब तापमान 19 से अधिक डिग्री सेल्सियस के करीब या कमरे के तापमान की अपेक्षा अधिक गर्म है, और चांदी अनाज पृष्ठभूमि प्राप्त की है. Darkroom में प्रकाश लीक के निम्न स्तर के संपर्क में पायस पृष्ठभूमि का कारण होगा. धोने फिक्सर नहीं काफी लंबे समय (पानी चलाने में कम से कम 30 मिनट), फिक्सर कि तो cresyl बैंगनी साथ प्रतिक्रिया करने के लिए पायस भर में एक भूरा वेग उत्पन्न छोड़ देंगे. हालांकि, अगर स्लाइड cresyl बैंगनी धुंधला से पहले निर्धारण के बाद 90 मिनट से अब पानी में धो रहे हैं, इस पायस ढीला और खराब दाग वर्गों बनने के लिए पैदा कर सकता है. यदि वहाँ पर्याप्त समय निर्धारण और धोने के बाद 30-90 मिनट की खिड़की के भीतर स्लाइड 30 मिनट धोने के बाद दाग नहीं है, स्लाइड रात भर सूखी और cresyl बैंगनी धुंधला हो जाना अगले दिन के साथ आगे बढ़ना. आम तौर पर, सबसे mRNAs विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न है, जबकि पृष्ठभूमि संकेत अधिक समान है. > e_content जोड़ ऊतक जीन अभिव्यक्ति के परिणाम के लिए एक्स – रे फिल्म पर गुमराह किया जा सकता है, गहरे संकेत के साथ एक क्षेत्र के लिए अग्रणी अगर ऊतक जोड़ रहा है, darkfield या cresyl बैंगनी दाग ​​वर्गों के तहत brightfield के तहत गैर दाग वर्गों की जांच करने के लिए निर्धारित है. Cresyl बैंगनी counterstaining ऊतक स्थिति की जांच करने के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान करता है. जांच विशिष्टता के एक बेहतर व्याख्या के लिए, नियंत्रण भावना जांच कई आसन्न वर्गों पर लागू किया जाना चाहिए. सबसे अधिक उपयुक्त जांच एक संकेत नहीं दिखा, लेकिन कुछ करते हैं, और जब वे करते हैं, हम पाते हैं कि यह अक्सर antisense संकेत से अलग है. हम मानते हैं कि इस संश्लेषण या जीनोम के antisense किनारा पर एक और जीन antisense संबंधित हो सकता है. हम एक उदाहरण में भावना Pax6 और antisense जांच (छवि 2A और बी) उपस्थित थे. antisense कतरा में अग्रमस्तिष्क सेरिबैलम, और उम्मीद के रूप में नजर (2A छवि) की निलय क्षेत्र साथ लेबलिंग से पता चलता है, लेकिन भावना ला पता चलता हैरेटिना वर्णक परत (छवि 2B) में beling. जांच के आकार के लिए, हम सीडीएनए की जांच के कहीं भी उपयोग 300-5000 बीपीएस की रेंज में है. कम से कम 300 बीपीएस काम है, लेकिन संकेत जांच आमतौर पर कमजोर है. हम 5000 बीपीएस से भी बड़ा जांच नहीं की कोशिश की है. यह सबसे अच्छा है एक ही प्रजाति से ऊतक पर जांच उपयोग के लिए यदि संभव हो तो. यदि नहीं, तो हम अन्य प्रजातियों के वर्गों पर जांच के पार से संकरण और संकरण कम होती है और 3-5 में तापमान डिग्री सेल्सियस अनुक्रम पहचान के आधार पर वेतन वृद्धि, अगर जाना जाता है धोने. यदि ज्ञात नहीं है, तो हम परीक्षण और त्रुटि संकरण प्रदर्शन और तापमान धोना. यदि तापमान भी बहुत कम है, सीडीएनए जांच प्रजातियों भर में या एक ही 11 प्रजातियों में इसी तरह के दृश्यों के अन्य mRNAs के साथ पार से संकरण कर सकते हैं. अभ्यास में, हम पाते हैं कि cDNAs कि ~ 95% समान या ऊतक में mRNA लक्ष्य, कड़े संकरण और धोने के तापमान (65 डिग्री सेल्सियस) स्थितियों के लिए अधिक से अधिक कर रहे हैं अच्छी तरह से काम करता है. दृश्यों कि बजाई में कर रहे हैं के लिए~ 85 94% समान, संकरण और धोने के तापमान के तों 50 ~ की रेंज में 60 सी. ° करने के लिए कम किया जा आवश्यकता हो सकती है कदम के अधिकांश में एक धातु रैक का उपयोग करने के लिए कारण क्लोरोफॉर्म washes और xylene का उपयोग है. दोनों ऑर्गेनिक्स प्लास्टिक के कई प्रकार पिघला. ग्लास और प्लास्टिक के कुछ प्रकार इन ऑर्गेनिक्स के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. लेकिन गिलास आसान है, को तोड़ने, और कुछ प्लास्टिक कि पहले से कम प्रतिरोधी रहे हैं ऑर्गेनिक्स के लिए जोखिम की लंबी अवधि से अधिक पिघल जाएगा. चित्रा 1 में स्वस्थानी संकरण एक्स – रे फिल्मों और पायस डूबा स्लाइड से छवियों की Autoradiography. (एबी) एक्स – रे फिल्म भ्रूण 10 दिन में ज़ेबरा चिड़िया songbird, antisense riboprobes साथ (ए) FoxP1 या (बी) CoupTF2, एक विदारक खुर्दबीन के नीचे brightfield रोशनी के साथ लिया संकरित के बाण के समान पूरे सिर वर्गों की छवियों. MRNA के व्यक्त दिखा फिल्म में ब्लैक, अनाज उजागरआयन. पैमाने बार = 500 माइक्रोन. (सीडी) पायस के बाद पक्षियों के बच्चे 6 दिन में बाण के समान ज़ेबरा चिड़िया के पूरे सिर वर्गों के स्लाइड छवियाँ डूबा, antisense riboprobes साथ (सी) FoxP1 और (डी) CoupTF2, एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे darkfield रोशनी के साथ लिया. संकरित व्हाइट, ऊतक mRNA अभिव्यक्ति दिखा ऊपर पायस में चांदी अनाज उजागर. लाल, cresyl बैंगनी दाग. पैमाने बार = 200 माइक्रोन. सभी चित्र के लिए, चोंच छोड़ दिया करने के लिए विजय – स्तम्भ है. एक्स – रे फिल्म छवियों को एक दिन, डूबा स्लाइड के लिए 3 दिनों के लिए खुल गए थे. FoxP1 जांच 1544-1711 बीपी हिस्सा mRNA की 178 बीपीएस है, 1-545 बीपी हिस्सा mRNA की CoupTF2 545 बीपीएस है. के रूप में देखा जा सकता है अग्रमस्तिष्क FoxP1 mRNA के भीतर (एम) mesopallium, striatum (सेंट) और पृष्ठीय थैलोमुस के (डीटी) में समृद्ध है, जबकि CoupTF2 (एन) nidopallium, arcopallium (ए) में समृद्ध है, और अधिक उदर थैलोमुस . जोखिम प्रकार (और उम्र) के बीच अभिव्यक्ति में स्थिरता है. डूबा स्लाइड के साथ, तथापि, एक उच्च संकल्प लेबलिंग देखा है, एकघ ऊतक सीमाओं और उप विभाजनों को सीधे पहचान कर रहे हैं. इन और अन्य सभी समाचार पत्र में दिखाया छवियों मानक 65 डिग्री सेल्सियस उच्च तंगी संकरण का उपयोग कर वर्गों से हैं. चित्रा 2 antisense और भावना लेबलिंग है कि अलग पैटर्न से पता चलता है की तुलना करें. (ए) Pax6 की antisense किनारा मस्तिष्क, विशेष रूप से वेंट्रिकुलर क्षेत्र (सफेद तीर) में व्यक्त किया गया था. दिखाया बाण के समान पूरे सिर भ्रूण 12 दिन में ज़ेबरा चिड़िया से लिया स्लाइस की एक्स – रे फिल्मों पर autoradiography है. (बी) निकटस्थ Pax6 की भावना किनारा के साथ संकरित अनुभाग भ्रूण सिर भर में कोई पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति, लेकिन रेटिना वर्णक परत (काला तीर) antisense किनारा के रूप में स्पष्ट अभिव्यक्ति पता चलता है. डैश्ड लाइन पूरे मस्तिष्क की समोच्च इंगित करता है. सी: सेरिबैलम. <st rong> 3 पायस डूबा ज़ेबरा चिड़िया मस्तिष्क से लिया brightfield और darkfield देखा गया है के तहत देर से भ्रूण चरणों के दौरान स्लाइड्स में जीन अभिव्यक्ति की स्वस्थानी संकेत. चित्रा. (ए) D1B अभिव्यक्ति की भ्रूण 10 दिन पर पायसन के लिए एक सामान्य प्रदर्शन से Brightfield छवि. लेबल (काला) मुश्किल से इस बढ़ाई देखा जा सकता है. 1-625 बीपी हिस्सा mRNA की जांच 625 बीपीएस है. (बी) और (ए), लेकिन के रूप में समान अनुभाग बढ़ाई darkfield लेबल दिखा striatum में (सफेद) दृश्य (सेंट) और चेतक (HI) के लिए बंद. (सी) पायसन के लिए एक से अधिक जोखिम से भ्रूण दिन 12 बजे Slit3 अभिव्यक्ति की Brightfield छवि. लेबल (काला) आसानी से देखा जा सकता है. जांच mRNA का हिस्सा 1243-2021 के लिए 779 बीपीएस है. (बी) और (ए) के रूप में समान अनुभाग बढ़ाई रीढ़ की हड्डी है कि (अनुसूचित जाति) brightfield छवि मैच में darkfield देखने दिखाने लेबल (सफेद) के लिए बंद. विजय – स्तम्भ छोड़ दिया करने के लिए उन्मुख है. सीबी: सेरिबैलम. / 3764/3764fig4.jpg "alt =" चित्रा 4 "/> चित्रा 4 रजत सेलुलर स्तर पर अनाज संकल्प. दिखाया ज़ेबरा चिड़िया अग्रमस्तिष्क में FoxP1 कोशिकाओं ऊपर चांदी (काले धब्बों) अनाज (cresyl बैंगनी) चित्रा 1 ए और 1C कम बिजली की छवियों के साथ तुलना में अलग मस्तिष्क क्षेत्रों और उम्र में mRNA लेबल है. (ए) व्यक्ति की कोशिकाओं पर उच्च बहुतायत वयस्क ज़ेबरा फिंच mesopallium में अभिव्यक्ति (काला तीर). (बी) एक ही अनुभाग के बगल nidopallium में व्यक्ति की कोशिकाओं (काला तीर) पर कम बहुतायत अभिव्यक्ति. (सी) उच्च FoxP1 कोशिकाओं से अधिक mRNA (भ्रूणीय दिन 12 mesopallium में काला तीर) अभिव्यक्ति. (डी) कोशिकाओं से अधिक कम बहुतायत एक ही अनुभाग के बगल nidopallium में अभिव्यक्ति (काला तीर). उदाहरण कोशिकाओं एक पीले रंग की लाइन के साथ परिक्रमा कर रहे हैं. भ्रूण कोशिकाओं (सी और डी) में छोटे होते हैं और अधिक मजबूती से वयस्क कोशिकाओं (ए और बी) के साथ तुलना में पैक. के बाद से वहाँ कोशिकाओं और पायस उजागर सी के क्षेत्र के बीच कुछ स्थान हैएस 35 जांच से lver अनाज सेल शरीर के क्षेत्र से थोड़ा बड़े हैं. पैमाने बार = 10 माइक्रोन.

Discussion

MRNA अभिव्यक्ति की स्वस्थानी संकरण में रेडियोधर्मी व्यापक रूप से क्षेत्रीय संगठन के ऊतकों, सेल प्रकार, और ^2-5,10,12-14 कार्यात्मक मस्तिष्क गतिविधि का अध्ययन करने के लिए सहित कई प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है. बाद में उपयोग के जीन जिनकी अभिव्यक्ति mRNA के मस्तिष्क में वृद्धि हुई तंत्रिका गतिविधि, अक्सर कहा जाता गतिविधि पर निर्भर जीन या तत्काल जल्दी जीन पर निर्भर है पर है. इन का उपयोग करता है के साथ, हमारे विधि कई प्रजातियों भर में लागू किया गया है पक्षियों में सहित, (जैसे मानव) स्तनधारी, मछली और amphibians, कई ऊतकों में, मस्तिष्क, त्वचा, और मांसपेशी सहित, और कई उम्र hatchlings / नवजात शिशुओं, किशोरों सहित, , वयस्कों, और पूरे भ्रूण वर्गों में यहाँ ^{2,3,5,15-17 के.} हमारे प्रोटोकॉल के विशेष सुविधाओं में शामिल हैं: (1) यह संरचनात्मक विशिष्टता और मात्रात्मक विशिष्टता के बीच एक संतुलन पैदा करता है. एक्स – रे फिल्म पर जीन की अभिव्यक्ति मात्रा ठहराना करने के लिए, हम छवियों की डिजिटल तस्वीरें ले (पूर्व: चित्र 1 ए और 1 बी), फोटो उपयोगtoshop हिस्टोग्राम (एडोब) हित के क्षेत्रों में पिक्सेल घनत्व को मापने और ऊतक के बाहर फिल्म पर पृष्ठभूमि के स्तर को घटाना, लेकिन अभी भी कांच ^2,4 स्लाइड पर समारोह. सेलुलर स्तर पर अभिव्यक्ति यों, हम उच्च वृद्धि (, 4 चित्र 40-100X) के तहत कोशिकाओं पर चांदी अनाज का चित्र लेने के लिए. हम तो वेन Rasband द्वारा NIH पर और छवि जम्मू की सीमा उपाय के कार्य करने के लिए छवि में चांदी अनाज की संख्या गिनती, गिलास स्लाइड पर कोशिकाओं के बिना बाहर एक समान क्षेत्र में पृष्ठभूमि गिनती घटाना का उपयोग करने के लिए, कक्षों की संख्या से विभाजित, सेल प्रति अभिव्यक्ति ^4,18 (2) यह अपेक्षाकृत उच्च throughput, एक साथ 100-200 स्लाइड के प्रसंस्करण की अनुमति कर सकते हैं, तंग coverslip खनिज तेल स्नान के द्वारा बनाई गई सील करने के लिए कारण का एक मान प्राप्त करते हैं. मानक में स्वस्थानी संकरण तरीकों अब लेने के लिए parafilm, नेल पॉलिश, और अन्य का मतलब है, जहां स्लाइड अंतरिक्ष के एक बहुत ले के साथ स्लाइड सील, (3) यह अत्यधिक हैकम बहुतायत Dextran सल्फेट और संकरण ^2,13 बफर में है Denhardt समाधान के कारण टेप के लिए संवेदनशील, (4) इमेजिंग दृष्टिकोण darkfield में उच्च विपरीत darkfield रोशनी के तहत एक विदारक ^4,5 खुर्दबीन पर चित्र लेने के लिए कारण छवियों पैदावार. इसके अतिरिक्त, यह गतिविधि पर निर्भर जीन अभिव्यक्ति में जीन की अभिव्यक्ति में जैसे छोटे परिवर्तन के प्रति संवेदनशील पता लगाने के विशिष्ट मस्तिष्क की धारणा और विशिष्ट ¹⁹ व्यवहार के उत्पादन के दौरान सक्रिय क्षेत्रों की पहचान करने की अनुमति देता है. गैर रेडियोधर्मी प्रोटोकॉल के सापेक्ष सीमाएं हैं कि बाद में सेलुलर संकल्प और कक्ष के भीतर mRNA की स्थिति में साफ है, और पायस साथ काम कर रहे बहुत हेरफेर और प्रकाश के प्रति संवेदनशील है. यह गैर रेडियोधर्मी के रूप में अन्य विधियों, स्वस्थानी संकरण में वही ऊतक ^10,17,20 में एक से अधिक जीन की mRNA अभिव्यक्ति लेबल के साथ हमारे विधि गठबंधन संभव है. यह immunocytochemistry साथ संयुक्त किया जा सकता हैएक ही नमूना पर दोनों शाही सेना और प्रोटीन अभिव्यक्ति के क्रम में कुछ सेल ¹⁰ प्रकार के साथ लेबल mRNA के सह – स्थानीयकरण. प्रोटोकॉल में डबल लेबलिंग प्रयोगों के लिए आवश्यक संशोधनों उद्धृत संदर्भ में वर्णित हैं.

सारांश में, हमारे दृष्टिकोण समय और जीन अभिव्यक्ति के सेलुलर स्थान की समझ की सुविधा क्षेत्र संगठन, ऊतक कार्यात्मक गतिविधि, और जीन समारोह में आदेश को समझने के लिए.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Acetic anhydride	VWR	MK242002
Chloroform	VWR	BDH1109
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Cryostat	Thermo scientific	Microm HM550
Deionized formamide	Sigma	F9037
DTT	Promega	P1171	100mM
EDTA	Sigma	ED
Embedding mold	VWR	15160-215
Fisher brand Superfrost plus slide	Fisher Scientific	22-034-979
Formaldehyde	VWR	BDH0506-4LP
Formamide	Sigma	F7508
GENECLEAN kit	Q-Bio gene	1001-200
Kodak BioMax MR film	Sigma	Z350370
Kodak NTB Emulsion	Carestream Health	8895666
Kodak Professional developer D19	Kodak	1462593
Kodak professional Fixer	Kodak	1971746
β-mercaptoethanol	Calbiochem	444203
Mineral oil	VWR	IC15169491
NaOH	VWR	SX0600-1
Paraformaldehyde	Sigma	76240
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
rATP	Promega	P1132	10mM
rCTP	Promega	P1142	10mM
rGTP	Promega	P1152	10mM
RNasin	Promega	N2111	40Units/μl
S35 UTP	PerkinElmer	NEG039C001MC
Safety-Solve solution	Safety Solve Research Products International	111177
Sodium Acetate	Sigma	S7899	3M
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S3139
SP6 RNA polymerase	Promega	P1085
Staining metal rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
T7 RNA polymerase	Promega	P2075
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
5x Transcription buffer	Promega	P1181
Triethanolamine	VWR	IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	VWR	101449-446
tRNA	Roche	10109509001

Solutions:

1. Reagents for making of riboprobes: 1.5 μl DNA template (0.2-0.3 μg/μl), 2 μl of 5x optimized transcription buffer, 1 μl of 100mM DTT (comes with Polymerase from Promega, mix well at room temperature), 0.3 μl of RNasin (40 units/μl), 1.5 μl of AGC ribonucleotide mix solution, 3.5 μl of S³⁵ UTP, and 1 μl RNA polymerase. Bring up to 10 μl with nuclease-free water.
2. AGC ribonucleotide mix solution: mix equal amounts of 10mM ATP, GTP and CTP together.
3. Sodium acetate solution for EtOH precipitation to remove free S³⁵ UTP: 40 μl RNase and DNase free water, 5 μl of 3M Sodium Acetate, and 125 μl of 100% EtOH.
4. Hybridization buffer (10ml stock): 5 ml of 100% deionized formamide, 600 μl of 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8.0), 240 μl of 0.5M EDTA (pH =8.0), 100 μl of 100x Denhart’s solution, 100 μl of 1M DTT, 250 μl of 20mg/ml tRNA, 125 μl of 20 mg/ml poly A, and 1 g of Sodium Dextran Sulfate. Add DEPC-treated water to bring the total volume to 10 ml. Shake vigorously and then incubate at 55°C until all sodium dextran sulfate is dissolved. Store the hybridization buffer in -20°C, which is good for ~6 months.
5. 4% buffered paraformaldehyde solution: Add 40 g of paraformaldehyde in 760 ml distilled water in a flask designated for paraformaldehyde, heat to 50°C on a hot plate while stirring. Add 320 μl of 10N NaOH to help dissolve the paraformaldehyde. After dissolving (~10 min), add 100 ml of 10x PBS, and bring the volume up with distilled water until 1 liter. Stir and heat the solution until paraformaldehyde is dissolved. The pH should be 7.4.
6. Acetylation buffer: 13.6 ml of triethanolamine plus 2.52 ml of acetic anhydride in 1 liter of distilled water.
7. 20x SSPE solution: 3M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄-H₂O, and 200 mM EDTA in distilled water. Adjust solution to pH 7.4 with 10N NaOH.
8. 10x PBS buffer: 80g of NaCl, 2.0g of KCl, 14.4g of Na₂HPO₄, and 2.4g of KH₂PO₄ in distilled water. Adjust solution to pH 7.0 and bring total volume to 1 liter.
9. Second wash solution: 0.1% β-mercaptoethanol and 50% formamide in 2x SSPE
10. Cresyl violet acetate solution: 3% cresyl violet acetate in tap water (distilled water prevents good staining), dissolved overnight with stirring in a flask at room temperature. Filter with vacuum suction through a 1mm Whatman filter paper and Buchner funnel.