Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Summary

Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilms met behulp van fluorescentie microscopie en flowcytometrie.

Abstract

Vorming van biofilm is een algemene eigenschap van bijna alle bacteriën ^1-6. Wanneer bacteriën biofilms vormen, cellen zijn ingekapseld in extracellulaire matrix die meestal wordt gevormd door eiwitten en exopolysacchariden, naast andere factoren ^7-10. De microbiële gemeenschap ingekapseld in de biofilm vaak toont de differentiatie van verschillende subpopulatie van gespecialiseerde cellen ^11-17. Deze subpopulaties bestaan ​​naast elkaar en vertonen vaak ruimtelijke en temporele organisatie binnen de biofilm ^18-21.

Biofilmvorming in het model organisme Bacillus subtilis vereist dat de differentiatie van de verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Onder hen, de subpopulatie van matrix producenten, verantwoordelijk voor het produceren en afscheiden van de extracellulaire matrix van de biofilm is essentieel voor biofilmvorming ^11,19. Vandaar dat differentiatie van de matrix producenten is een kenmerk van biofilmvorming in B. subtilis.

We hebben fluorescerende verslaggevers voor het visualiseren en kwantificeren van de subpopulatie van matrix producenten in biofilms van B. subtilis ^15,19,22-24. Concreet, hebben wij waargenomen dat de subpopulatie van matrix producenten maakt in reactie op de aanwezigheid van zelf geproduceerde extracellulaire signaal surfactin ^25. Interessant is surfactin door een subpopulatie van gespecialiseerde cellen verschillend van de subpopulatie van matrix producenten ^15.

We hebben beschreven in dit rapport de technische benadering nodig is om te visualiseren en kwantificeren van de subpopulatie van matrix producenten en surfactin producenten binnen de biofilms van B. subtilis. Om dit te doen, zijn TL-verslaggevers van genen die nodig zijn voor matrix productie en surfactin productie ingebracht in het chromosoom van B. subtilis. Reporters worden uitgedrukt slechts in een subpopulatie van gespecialiseerde cellen. Vervolgens kan de subpopulaties zijngecontroleerd met behulp van fluorescentie microscopie en flowcytometrie (zie afb. 1).

Het feit dat verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen naast elkaar bestaan ​​binnen meercellige gemeenschappen van bacteriën geeft ons een ander perspectief over de regulatie van genexpressie bij prokaryoten. Dit protocol heeft betrekking op dit fenomeen experimenteel en kan eenvoudig worden aangepast aan elke andere bewerkingen model, om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische heterogeniteit binnen een microbiële gemeenschap toe te lichten.

Protocol

1. Labeling B. subtilis en biofilmvorming Assay Versterken door PCR van de promoter van het gen van belang. We tonen als voorbeeld het klonen van P TAPA, de promotor van de genen voor de productie van TASA matrix eiwit 26. Clone P tapa in pkm008 vector (gemaakt door de Rudner lab, Harvard Medical School. Boston, USA) (fig. 2). Lineariseren de plasmiden door enzymatische digestie (Enzyme aanbevolen, Xhol). Laten natuurlijke compete…

Discussion

Dat bacteriële subpopulaties van cellen die specifieke set van genen bewijzen de complexiteit van microbiële ^33,34 weergegeven. Dit protocol zou te bepalen of de expressie van een gen van belang wordt beperkt tot een bepaald subpopulatie van gespecialiseerde cellen in de microbiële. Visualisatie van deze subpopulaties vereist de ontwikkeling van nieuwe technieken, omdat de traditionele methoden om de gen-expressie of microarray analyse beoordeling van de niveaus van genexpressie om de hele microbiële geme…

Materials

Technique	Name of the reagent	Company	Catalog number
MSgg composition	potassium phosphate 5mM	Roth	6878
	MOPS 100mM	Sigma-Aldrich	M1254
	Magnesium chloride 2mM	Roth	2189.1
	Calcium chloride 700μM	Roth	A119.1
	Ferric chloride 50μM	Sigma-Aldrich	157740
	Zinc chloride 1μM	Applichem	A2076
	Thiamine 2μM	Sigma-Aldrich	74625
	Glycerol 0.5%	Roth	7533
	Glutamate 0.5%	Sigma-Aldrich	49621
	Tryptophan 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
	Phenylalanine 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Cell fixation	Paraformaldehyde	Roth	0335
	Name of the equipment	Company	Catalog number
Sonication	Cell Sonicator	Bandelin	D-1000
Fluorescence Microscopy	Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000B
	Name of the software	Company	Catalog Number
Fluorescence Microscopy	AsaF	Leica
Flow cytometry	FCASDiva	BD
Flow cytometry	FlowJo	Treestar