JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis Biyofilmler

Published: February 15, 2012
doi:
10.3791/3796
, , ,
1Institute for Molecular Infection Biology (IMIB),University of Würzburg

Summary

Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol tarif<em> B. subtilis</em> Floresan mikroskobu ve akım sitometri kullanarak biyofilm.

Abstract

Biyofilm oluşumu hemen hemen tüm bakterileri 1-6 genel bir niteliktir. Bakteriler biyofilmler oluştururlar, hücreler çoğunlukla 7-10 diğer faktörler arasında proteinler ve ekzopolisakkarit tarafından oluşturulmuştur hücre dışı matris içinde kaplı vardır. Mikrobiyal topluluk genellikle 11-17 özel hücreler farklı subpopülasyonu farklılaşması gösterir biyofilm içinde kaplı. Bu subpopülasyonunun arada ve genellikle 18-21 biyofilm içinde zamansal ve mekansal organizasyonu gösterir.

Model organizma Bacillus subtilis Biyofilm oluşumu özel hücreler farklı alt popülasyonlarının farklılaşmayı gerektirir. Bunlar arasında, biyofilm hücre dışı matriks üretmek ve salgılamak sorumlu matriks üreticileri, en subpopülasyonu 11,19 biyofilm oluşumu için gereklidir. Bu nedenle, matris üreticilerinin farklılaşması B. biyofilm oluşumu hallmark subtilis.

Biz B. Biyofilmlererde matris üreticilerin subpopülasyonu görselleştirmek ve ölçmek için floresan gazetecilere kullanmış subtilis 15,19,22-24. Somut olarak, bu matris üreticilerinin subpopülasyonu kendi ürettiği ekstraselüler sinyal surfactin 25 varlığında karşılık olarak ayırt olduğu araştırmacılar tarafından gözlenmiştir. İlginç bir şekilde, surfactin matris üreticileri 15 subpopülasyonu farklı özelleşmiş hücre bir alt tarafından üretilir.

Bu raporu B. subtilis biyofilmler içinde matrisi üretici ve surfactin üreticilerin subpopülasyonu görselleştirmek ve ölçmek için gerekli teknik yaklaşım ayrıntılı var. Bunu yapmak için, matris üretimi ve surfactin üretimi için gerekli olan genlerin flüoresan gazetecilere B'nin kromozom içine sokulur subtilis. Reporters sadece özel bir hücre subpopülasyonu cinsinden ifade edilmiştir. Daha sonra, alt popülasyonlar olabilirfloresan mikroskobu ve akım sitometri (Şekil 1'e bakınız) kullanılarak izlenir.

Özel hücrelerin farklı alt popülasyonlarda bakterilerin çok hücreli topluluklar içinde bir arada olması, bize Prokaryotlarda gen ifadesinin düzenlenmesinde hakkında farklı bir bakış açısı kazandırır. Bu protokol deneysel olarak bu fenomeni adresleri ve kolay bir mikrobiyal topluluk içinde fenotipik heterojenite altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, başka herhangi bir çalışma modeline adapte edilebilir.

Protocol

1. Etiketleme B. subtilis ve Biyofilm Oluşumu Deneyi PCR ile, ilgilenilen geni promoter bölgesi amplifiye. Bu örnek olarak P tapa, Tasa matriks proteini 26 üretimi sorumlu genlerin klonlanması arttırıcının göstermektedir. Pkm008 vektör (Özlü laboratuar, Harvard Tıp Okulu. Boston, ABD tarafından yaratılmış) içine Clone P tapa (Şekil 2). Enzimatik sindirimi (Enzyme önerilen, XhoI) ile plazmit doğrusallaştırmak. <l…

Discussion

Bakteri toplulukları genler delillerin mikrobiyal topluluklar 33,34 karmaşıklığı belirli ifade hücrelerin subpopülasyonunun gösteriyor olması. Bu protokol ilgi herhangi bir gen ekspresyonu mikrobiyal toplum içinde özel hücreler belli bir subpopülasyonu kısıtlı olup olmadığını belirlemek için yardımcı olmalıdır. Geleneksel yöntemlerin bütün mikrobiyal topluluk ve mikrobiyal toplum içinde gen ekspresyon dalgalanmalara gen ekspresyonu veya mikroarray analizi oranı gen ekspresyonu d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Würzburg Üniversitesi Enfeksiyon Hastalıkları Araştırma Merkezi (ZINF) gelen, Genç Araştırmacı Araştırma Programı tarafından finanse edilmektedir. Juan C Garcia-Betancur Würzburg Üniversitesi Yaşam Bilimleri Enstitüsü (GSLS) bir doktora üyesidir.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  2. Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).
  3. Kolenbrander, P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).
  4. O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  5. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).
  6. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Biofilms. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).
  7. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  8. Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
  9. Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. Biofilm-associated proteins. C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).
  10. O’Gara, J. P. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).
  11. Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).
  12. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).
  13. Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation. PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).
  14. Kearns, D. B., Losick, R. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).
  15. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Paracrine signaling in a bacterium. Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).
  16. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).
  17. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media. J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).
  18. Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).
  19. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
  20. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).
  21. Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  22. Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms. MBio. 1, (2010).
  23. Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
  24. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).
  25. Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).
  26. Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
  27. Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
  28. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).
  29. Yasbin, R. E., Young, F. E. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1. J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).
  30. Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
  31. Nakano, M. M. srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).
  32. Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science. 301, 510-513 (2003).
  33. Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).
  34. Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).

Tags

Single-cell AnalysisBacillus SubtilisBiofilmsFluorescence MicroscopyFlow CytometryExtracellular MatrixProteinsExopolysaccharidesSpecialized CellsSpatial OrganizationTemporal OrganizationMatrix ProducersFluorescent ReportersSurfactin
check_url/3796?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image