분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이
Summary
앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한 방법입니다<em> Toxoplasma</em>는 숙주 세포에서 egresses. 프로토콜은 화학적으로 기생충을 mutagenize 위해 제공, 유도 탈출구 결함있는 돌연변이에 대한 풍부하고, 복제된 돌연변이 표현형을 검증하고 있습니다.
Abstract
널리, 고맙게 여기게 세포내, protozoan 기생충 Toxoplasma gondii는 immuno-감염된 환자에서 기회 질환의 원인과 선천성 감염시 태아에 악영향을 끼친다. 1 : lytic 복제주기가 3 단계이 특징입니다. nucleated 숙주 세포의 활성 침공 2. 숙주 세포 안에서 복제 3. 숙주 세포에서 활성 탈출구. 탈출구의 메커니즘은 점점 여전히 저조한 분자 수준에서 이해하는 독특한, 높은 규제 프로세스로 평가되고있다. 탈출구의 기본 신호 전달 경로는 경로 1-5의 다양한 측면에서 행동 pharmacological 대리인의 사용을 통해 특성화되었습니다. 따라서 탈출구 여러 독립적인 트리거는 모든 세포 내 칼슘 2의 릴리스에 수렴하는 확인되었습니다 +, 또한 숙주 세포 침입 6-8에 중요 신호. 이러한 통찰력은 identi로 이끌었 후보 유전자 접근 방법을 알려탈출구 9 관련된 칼슘 의존 단백질 키나제 (CDPK)과 같은 식물의 fication. 또한, 이해 탈출구 여러 최근의 획기은 (화학) 유전 접근법에게 10-12를 사용되었습니다. Toxoplasma의 증가 유전자 접근으로 pharmacological 정보의 재산을 결합하기 위해 우리는 최근에 호스트 세포 밖으로 나가기 13 결함있는 기생충 뮤턴트 농축을 허용 화면을 설립했습니다. N-에틸-N-nitrosourea (ENU) 또는 에틸 methanesulfonate (EMS)를 사용하여 화학적 돌연변이 유발이 Toxoplasma 생물학 11,14,15의 연구에서 수십 년간 사용되고 있지만, 최근에 밑에 변이 유전자 매핑을 가지고 phenotypes는 일상 16가 -18. 또한, 온도에 민감한 돌연변을 생성하여 필수적인 프로세스를 해부 수 있으며 기본 유전자 직접 확인. 이러한 돌연변이가 허용 온도 (35 ° C) 이하 야생 형 답게 행동하지만, p로 실패문제의 돌연변이의 결과로 제한 온도 (40 ° C)에서 roliferate. 여기에서 우리는 온도에 민감한 탈출구의 표현형 13 돌연변이를 분리하기 위해 새로운 phenotypic 심사 방법을 설명합니다. 탈출구 화면에 대한 도전은 다시 침략 및 호스트 세포에 기생충 일반 끈적 거림 빨리 복잡하지 않은 egressed 기생충에서 egressed 분리하는 것입니다. 이전에 설립 탈출구 화면이 세포외 기생충 11 일부터 세포 분리 biotinylation 단계의 성가신 시리즈를 기반으로했다. 이 방법은 또한 약한 phenotypes 결과 조건부 돌연변이 생성되지 않았습니다. 여기서 설명한 방법은 숙주 세포 19 고집에서 기생충을 방지 glycan 경쟁, dextran 황산 (DS)를 포함하여 기생충을 egressing의 강한 첨부 파일을 극복. 또한, 세포외 기생충은 특히 세포내 기생충을 떠나는 pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)에 의해 죽였으니있다20 무사히. 따라서 구체적으로 유도 탈출구 결함과 기생충 돌연변이를 분리하기 위해 새로운 phenotypic 화면, 유전학의 전원은 이제 완벽하게 숙주 세포의 출현의 기초 분자 메커니즘을 해명하도록 배포할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
설명한 프로토콜은 탈출구 결함으로 Toxoplasma 돌연변이를 분리하는 효율적인 방법을 제공합니다. 우리는 성공적으로 이중 침략의 표현형 13 일부 중 탈출구 경로의 여러 단계에 따라 돌연변이를 분리했습니다. 침략에 대한 잠재적인 효과는 차동 항체 염색법 23,24으로 비 침략 기생충으로부터 침공 차별화 소위 빨강 녹색 검정을 사용하여 결정하실 수 있습니다. 침략과 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 심장 협회 과학자 발달 그랜트 0635480N 및 건강 연구 보조금 AI081220 국립 연구소에 의해 재정 지원되었다. BIC은 성당 기사단이 눈 재단 연구 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher & Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective |
HBSSc (according to Black et al.11):
- 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
- 100 μl 1M MgCl2 (100 mM end)
- 100 μl 1M CaCl2 (100 mM end)
- 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
- 84 mg NaHCO3 (10 mM end)
References
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
- Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
- Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
- Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
- Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
- Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
- Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
- Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
- Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
- Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
- Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
- Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
- Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
- White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
- Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
- Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
- Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
- Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
- Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
- Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
- Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
- Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
- Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).
