Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores
Summary
Desenvolvemos um novo protocolo para melhorar a eficiência de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias em neurônios motores. As células-tronco diferenciadas adquirido neurônios motores apresenta como evidenciado pela expressão de marcadores neuronais e neurônio motor utilizando técnicas de imuno-histoquímica.
Abstract
Diferenciação direta de células tronco embrionárias (ES), as células em neurônios funcionais motoras representa um recurso promissor para estudar mecanismos da doença, para filtrar compostos de drogas novas, e para desenvolver novas terapias para doenças do neurônio motor, tais como atrofia muscular espinhal (AME) e esclerose lateral amiotrófica ( ALS). Muitos protocolos actuais usar uma combinação de ácido retinóico (RA) e hedgehog sónica (Shh) para diferenciar estaminais embrionárias de rato (MES) em células do motor neurónios 1-4. No entanto, a eficiência de diferenciação de células de MES em neurónios do motor tem apenas um sucesso moderado. Nós desenvolvemos um protocolo de diferenciação de dois passos 5, que melhora significativamente a eficiência de diferenciação em comparação com os protocolos actualmente estabelecidas. O primeiro passo é melhorar o processo de neuralization por adição de noggin e factores de crescimento de fibroblastos (FGFs). Noggin é uma proteína morfogenética do osso antagonista (BMP) e está implicado na indução neural umae acordo com o modelo padrão de neurogênese e resulta na formação de padrão neural anterior 6. FGF sinalização age sinergicamente com Noggin na indução de formação de tecido neural através da promoção de uma identidade posterior neural 7-9. Neste passo, as células foram condicionadas com MES Noggin, bFGF, e FGF-8 durante dois dias para promover a diferenciação para linhagens neurais. O segundo passo é o de induzir a motor especificação neurónio. Noggin / FGFs expostas células foram incubadas com MES RA e um agonista de Shh, agonista Smoothened (SAG), durante mais 5 dias a fim de facilitar a motor geração neurónio. Para monitorizar a diferenciação de neurónios motores em MES, utilizou-se uma linha de células ES derivado de um ratinho transgénico eGFP expressando sob o controlo do promotor de neurónio motor específico Hb9 1. Usando este protocolo robusto, obtivemos 51 ± 0,8% de eficiência diferenciação (n = 3, p <0,01, teste t de Student) 5. Os resultados de imunofluorescênciacoloração revelou que as células GFP + de expressar os marcadores neuronais específicas, a motor Islet-1 e de colina-acetiltransferase (ChAT). Nosso protocolo de diferenciação em duas fases fornece uma forma eficiente de diferenciar as células MES em neurônios motores da coluna vertebral.
Protocol
Discussion
A qualidade de células MES é o parâmetro mais crítico para a geração eficiente de neurónios motores. células de MES deve ser cultivado em PMEF para impedir a diferenciação espontânea. A adição de LIF ajuda a manter as células MES em um estado indiferenciado. Como as células de MES dividir cada h 12-15, o meio de cultura se torna empobrecido rapidamente e deve ser substituído por dia.
Activação eficiente da via Shh é um parâmetro crítico necessário para induzir a motor e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito é dedicado à memória do Dr. Wenlan Wang, que faleceu em 26 de maio de 2011. Agradecemos ao Dr. Douglas A. Kerr para generosamente fornecer os HBG3 células MES utilizados neste estudo. Este trabalho foi financiado por Nemours, uma bolsa (2 RR016472-10) no âmbito do programa INBRE do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (NCRR), e um COBRE Prêmio da NCRR (5 P20 RR020173-05) para apoiar o Centro de Pesquisa Pediátrica do I. Alfred duPont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, EUA.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
References
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